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KEY WORDS: hepatitis B virus; genotype; microboard nucleate molecular hybridization; function of liver
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染后的临床过程多种多样,除了与宿主的免疫状况、感染方式等有关,与感染病毒株的基因型种类也关系密切。不同基因型的HBV代表着在生物学特性方面的差异，HBV基因分型有助于对病情、治疗及预后的评价。目前各地区的检测方法不同，研究的结论不尽相同。我们采用微板核酸杂交ELISA技术进行基因分型，并同时测定肝功能，评价其对肝功能的影响。
1 材料与方法
1.1 临床资料
93例患者均来自西安交通大学医学院第一附属医院传染科2005年6月～2005年11月住院患者。诊断标准符合2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》，所有患者均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒混和感染及其他原因引起的肝炎，既往未曾进行抗病毒治疗。其中亚急性重型肝炎4例，慢性乙型肝炎中度25例，重度24例，乙肝肝硬化28例，肝癌12例，男70例，女23例，年龄19～68岁，平均年龄42.40岁。所有血液标本均新鲜分离血清，-25℃保存，待整批检测。
1.2 试剂和仪器
HBV基因分型PCR微板核酸分子杂交ELISA试剂盒由第一军医大学基础部生物医学诊断研究中心提供。DG3022A型酶标仪为国营华东电子管厂生产。9700型基因扩增仪为美国PE公司生产。
1.3 检测方法
1.3.1 采用微板核酸杂交ELISA技术进行基因分型
①引物及探针：根据HBV 6个基因型的特异基因序列，选择前C区的不同序列作为PCR引物和核酸杂交探针，6个基因型通用的序列作为PCR的引物和通用包被探针，而同一部位的不同序列作为各型的显色探针，并采用Primer软件设计引物和探针。显色探针5标记Biotin由上海生物工程有限公司合成。序列为：引物W1：CCCTTCTTCGTCTCGCGGTTCC(nt 1490～1510);引物W2：ACCAATTTATGCCTACAGCCTC(nt 1798～1777)医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
②HBVDNA的提取及扩增：取处理液100μL于0.5mL离心管内，加待测血清100μL，混匀，100℃煮沸15min，12000r/min离心5min，取上清液作为扩增模板。取上清液12μL于反应液管内，弹匀，10000r/min离心10s，上机循环，预变性94℃ 2min，循环条件：94℃ 50s、55℃ 50s、72℃ 65s，共循环38次，最后72℃延伸3min。
③微板杂交及酶联显色：将扩增产物98℃变性10min，迅速冰浴10min。各取杂交液90μL，各型显色探针25μL，已变性产物20μL，分别加入反应孔内，轻轻混匀，50℃水浴60min。轻轻弃去上清液后加入200μL杂交洗液，50℃洗涤3～5min，共3次。每孔中加入100μL酶抗体，37℃孵育30min后，轻轻弃去上清液，加入200μL酶洗液，置37℃ 3～5min，再重复洗2次。每孔加显色剂A、B各1滴，避光，置37℃ 10min后加入终止液1滴，在450nm波长处检测A值。
④结果判断：P/N≥3.0为HBVDNA阳性，P/N<3.0为阴性(阴性对照A值小于0.05，按0.05计算：P/N比值=标本A值/阴性对照A值)。
