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1.1 动物、试剂及仪器
健康SD大鼠35只,雌雄不限,体质量约350g,由江苏大学动物实验中心提供,动物使用许可证:SCXK(苏)20020045, 于本院中心实验室动物房饲养,光照昼夜交替,房间温度20～26 ℃,湿度低于80%。异丙醇、无水乙醇、氯丙醇(国药集团化学试剂有限公司),Trizol(Invitrogen公司),DEPC水(上海生工生物工程有限公司),逆转录及RTRCR试剂盒(TaKaRa公司),高速离心机(Eppendolf centrifuge 5804R,德国),紫外分光光度计(Eppendolf Biophotometer,德国),RTPCR仪器(MX3000P real time PCR，美国Stratagene公司)。
1.2 方 法
1.2.1 动物模型的制作 精选体质量、年龄都相当的大鼠,称重后0.2%(0.2 ml/100 g)盐酸氯胺酮腹腔注射,麻醉成功后固定大鼠于鼠板,备皮手术区,消毒,沿肌间隙分离显露左侧股骨,于股骨干中部离断一骨段,包括骨外膜,按骨髓腔直径大小选择相应规格克氏针髓腔内固定,造成5 mm股骨骨缺损,冲洗伤口,抗生素预防感染,逐层缝合至皮肤,右侧股骨同样按上述程序处理,但不做骨缺损而直接缝合伤口,后期取材作为正常对照以计算缺损区相对于正常骨组织的相对扩增倍数。造模后大鼠置于鼠笼中自由活动,饲料正常喂养,每天观察活动和进食情况至伤口愈合。
1.2.2 实验分组 分为取材前35天、28天、21天、14天、7天、3天、1天7个时段,每个时段随机选取5只SD大鼠造模,同一天处死取材。实验组和对照组均标记骨缺损中心区和外周区。
1.2.3 RNA的提取 取出冻存标本组织,按标记的外周区和中心区分别取材。中间缺损区域定为中心区(即缺损区域中心点向远近端各2.5 mm的范围),中心区边缘向远近端各5 mm定为边缘区(即缺损区域中心点向远近端2.5～7.5 mm的范围)。称重约90 mg的组织置于无菌的研钵中,液氮研磨至粉末状,按Trizol法提取总RNA,紫外分光光度计测光密度值,检测各样品中总RNA的含量及纯度,-20 ℃保存医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
1.2.4 引物设计 BMP2基因:上游CGGAAGCGTCTTAAGTCCAG、下游CATGCCTTAGGGATTTTGGA;β肌动蛋白基因:上游ATGTTTGAGACCTTCAACAC、下游CACGTCACACTTCATGG。
上述待测基因从基因库中查出,引物由上海生工设计合成。
1.2.5 逆转录 按照试剂盒说明书操作。
1.2.6 PCR反应 SYBR Green法,具体操作按照TaKaRa公司试剂盒说明书进行扩增。
1.2.7 结果计算 对照组SD大鼠股骨作为阳性对照,以去离子水作为阴性对照。所有样本PCR反应均做复孔,取其平均值作为结果。以公式2-△△CT计算骨缺损模型外周区及中心区BMP2基因在相应区域相对于正常骨组织的表达倍数[1]。
1.2.8 统计学方法 利用统计软件SPSS13.0。BMP2在各个时段外周区和中心区的表达比较,采用独立两样本t检验; BMP2在外周区和中心区各个观察时段的表达比较,用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
