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慢性高原病(chronic mountain sickness，CMS)是高原低压缺氧环境引起的一类高原特发性疾病，随海拔增高其发病率呈增高趋势。经多年研究，对红细胞增殖相关机制有了比较清楚的认识，但对CMS尚存很多问题有待进一步阐明。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群主要存在于骨髓中的非造血细胞，在体外不同的诱导条件下可分化为多种细胞。除具有多向分化潜能外，MSCs还表达多种造血细胞因子，又能分化为支持造血的骨髓基质细胞，且与造血干细胞的归巢密切相关，具有强大的支持造血及免疫调节等功能，具有广泛的临床应用价值[1]。目前对CMS患者的MSC相关研究未见报道，故在此我们探讨CMS患者骨髓MSCs的体外培养方法、生物功能及分子生物学特征。以期进一步深化对CMS发病机制的研究。
1 资料与方法
1.1 病例资料
选择15例就诊于青海大学附属医院血液科的CMS患者(CMS组)。患者均为男性，年龄32～45岁，诊断符合第六届国际高原大会2004年制订的青海诊断标准[2]。15例对照组骨髓来源于血象和骨髓象正常的外伤性骨折患者的肋骨骨髓，选自青海大学附属医院骨科患者，本组患者均为男性，年龄24～48岁。两组间性别、年龄差异无统计学意义医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
1.2 实验方法
1.2.1 骨髓MSC的分离培养：无菌条件下以CMS患者髂后上嵴为穿刺部位，抽取骨髓液5 mL(以肝素钠抗凝)，以等体积低糖DMEM稀释;对照组在无菌条件下将肋骨髓腔以低糖DMEM冲洗后收集骨髓液。稀释后的骨髓用密度为1.073 g/mL的Percoll分离液(Pharmacia公司)分离单个核细胞，DMEM洗涤2次，悬浮于含10%胎牛血清(FBS,Hyclon,美国)的DMEM/F12培养液(Gibco公司)中，采用直接贴壁法，以含10%胎牛血清的DMEM/F12作为培养液，即hMSCs培养液(mesencult medium,stem cell Tech公司)。25 cm2塑料培养瓶(Costar)接种5×106个单个核细胞，置于37℃、5%CO2的饱和湿度细胞培养箱内培养。72 h后弃掉未贴壁细胞，更换培养液，以后每 3～4 d换液1次，待细胞生长达90%融合时，用0.25%胰蛋白酶/EDTA(Gibco公司)在37℃下消化贴壁细胞，收集细胞并悬浮于hMSCs培养液，按1∶3比例传代培养，并标记为P1;此后可依此传代培养。传代过程中每隔3 d全量换培养液，直至贴壁细胞彼此融合,铺满整个培养瓶的底面;再重复以上的操作，将贴壁细胞消化分离，并按1∶2的比例进行下一代的传代接种培养，并标记为P2。
1.2.2 MSC的形态学鉴定：每日在倒置显微镜下观察贴壁细胞的细胞形态、密度和生长情况，取1、3、6代MSC，置于有玻片的3.5 cm直径平皿中，于37 ℃、体积分数为5% CO2的饱和湿度环境下培养1周，取出风干，用瑞士姬姆萨染色后在显微镜下观察细胞形态。
1.2.3 MSC表面标志的测定：以0.25%胰蛋白酶消化收获细胞，用PBS洗涤后计数，取2×106个细胞分别与 PE或 FITC标记的鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD13、CD14、CD3、CD4、CD8(BD公司)、CD105(Caltag公司)、HLADR和CD20单克隆抗体室温避光反应30 min，用PBS洗涤2次(1000 r/min,5min/次);加1%多聚甲醛1 mL，摇匀，4℃保存，1周内用流式细胞仪(FACSCaliburBD公司，Cellquest软件分析)确定所分离培养的MSCs的表型和纯度。
