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氧化苦参碱(Oxymatrine ,Oxy)是从苦豆子中分离提纯具有四环喹嗪结构的生物碱。本室前期实验研究发现并已证实Oxy具有抗癫痫作用。为进一步探讨Oxy可能的抗癫痫机制,本实验通过青霉素致痫大鼠模型,采用免疫组化法检测癫痫大鼠脑组织海马区p-ERK 1/2与NR2B表达含量,探讨二者的关系以及Oxy抗癫痫作用的可能机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物：Sprague-Dawley大鼠(宁夏医科大学实验动物中心提供)，雌雄不限，体重200-250g ,随机分组。
1.2 实验试剂及仪器：氧化苦参碱(宁夏紫荆花药业生产,批号为960304) ;苯巴比妥钠(PBS，上海新亚药业有限公司生产,批号为040603) ;青霉素(PEN，宁夏启元药业有限公司生产,批号为050703) ;多聚甲醛(北京益利精细化学品有限公司生产,批号为20020203) ;SABC 试剂盒、浓缩型DAB 试剂盒、磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司生产) 。石蜡切片机、光学显微镜。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物分组及给药:选取健康SD大鼠(雌雄不拘)78只，随机分为四组(各组按0.5、1.5、6和12h 时间点又分为四组，每组6只)：①正常组：腹腔注射生理盐水。②癫痫组：腹腔注射PEN，从出现Racine分级标准III级发作开始计时。③PBS阳性对照组：预先腹腔注射PBS 10mg/kg。④OXY预处理组：预先腹腔注射Oxy 147.45mg/kg(ED50)。
1.3.2 模型复制及大鼠癫痫行为学分级:除正常对照组和癫痫组外,其它各组大鼠0.5h后腹腔注射PEN 600万U/ kg。根据Racine分级法，动物痫性发作III级(前肢阵挛、后肢站立)或III 级以上发作视为达到点燃标准。
1.3.3 大鼠脑组织海马区p-ERK 1/2与NR2B阳性神经元测定：(1)灌注和取材： 20% 乌拉坦(1g/kg)腹腔注射，麻醉后开胸沿左心室向升主动脉插管固定，灌入生理盐水冲净血液，然后换4%多聚甲醛戊二醛混合液进行内固定。断头取脑置入固定液中24 h, 石蜡包埋后作冠状切片用于免疫组织化学染色。(2)p-ERK 1/2与NR2B免疫组织化学染色采用SP法。
1.4 统计学方法:所有实验数据均用±s表示,采用SPSS 15.1 统计软件进行方差分析和t检验。
2 结果
2.1 各组动物行为学观察：生理盐水组大鼠活动正常，PBS组表现安静，无癫痫发作。Oxy组在腹腔注射PEN后经20-30min出现须动、点头和咀嚼样动作，但未出现全身强直、阵挛抽搐、跌倒。PEN组大鼠在PEN腹腔注射后经10-15min潜伏期后 ,出现阵发性须动、点头和咀嚼样动作，至0.5h左右有面肌抽动、前肢阵挛、姿势失衡，继之发生全身强直，阵挛抽搐，常反复发作, 2 h后大部分动物停止发作。
2.2 免疫组化染色检测:生理盐水组大鼠大脑海马内未见p-ERK1/2阳性神经元且NR2B仅有少量表达。经PEN致痫1.5h后，与生理盐水组相比大鼠海马内p-ERK1/2阳性神经元表达显著增多(P<0.01)，NR2B在6h表达亦明显增多。PBS组、Oxy组在腹腔注射PEN后海马内开始出现p-ERK1/2阳性神经元,同时NR2B阳性神经元逐渐增多。与PEN组相比PBS组、Oxy组大鼠海马内p-ERK1/2阳性神经元表达减少(P<0.01),NR2B表达低于PEN组(P<0.01)。在PEN组、PBS组和Oxy组中p-ERK1/2阳性神经元表达数量在1.5h达到最高值,6 h后表达下降 ;NR2B在6h组表达量最多，以后逐渐下降(表1、图1，见封二)。表1 各组大鼠癫痫发作前后海马内p-ERK1/2和NR2B免疫阳性细胞数注：与生理盐水比较^P<0.01;与癫痫组比较，△P<0.01;生理盐水各时间点p-ERK1/2与NR2B变化不显著，故表中未一一列出医.学全.在.线网站www.lindalemus.com
