1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 健康2月龄普通级豚鼠,体重240~320 g,雌雄不拘,由南通大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号:SCXK(苏)2001-0011。实验期间分笼饲养于安静室内,自然光照,室温20~26 ℃,湿度40%~70%,饲喂全价颗粒料和新鲜蔬菜,每周换垫料1次。
1.1.2 药品及试剂 健儿强身膏口服液:由南通市中医院制剂室按制备工艺生产提供,每毫升相当于生药1 g[生产批文号:通制剂(2001)04—125]。药物主要组成成分:党参、炒白术、茯苓、炒白芍、山药、炒谷麦芽、焦楂曲、黄芪、黄精、南北沙参、菟丝子、山芋肉、桑葚子、女贞、生熟地、川断、陈皮、甘草、仙灵脾、天麦冬、蒸百部、红枣、浮小麦、法半夏、黄芩、补骨脂。阳性对照药:地塞米松磷酸钠注射液(江苏涟水制药有限公司,批号:0411171)。致敏剂:卵蛋白(OVA),上海伯奥生物科技有限公司,批号0050114。
1.1.3 主要仪器 PARIBOY超声雾化机,德国百瑞;密闭透明容器(320 mm×260 mm×200 mm),自制;奥林巴斯CX41显微镜,日本;形态图像分析系统,南京捷达公司;外科手术器械1套。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及剂量 取符合实验要求的豚鼠48只,随机分成6组:空白对照组(正常组)、哮喘模型组、地塞米松治疗组:地塞米松1 mg/kg体重、健儿强身膏低剂量组:生药4 g/kg体重、健儿强身膏中剂量组:生药8 g/kg体重、健儿强身膏高剂量组:生药16 g/kg体重,每组8只。
1.2.2 造模及给药方法 按照国际上通用的方法,以经典的卵蛋白致敏和攻击复制动物模型[4]。除空白对照组外,其余各组动物每只分别腹腔注射10%卵蛋白生理盐水溶液1 ml致敏,于第15、16、17天,将豚鼠逐个放入自制密闭容器中,超声雾化机衡压喷入1%卵蛋白生理盐水溶液30 S任其自由吸入,观察豚鼠呼吸节律、深度、膈肌收缩及有无抽搐跌倒等呼吸道痉挛梗阻等症状。其强度可分为四级:Ⅰ:呼吸加剧;Ⅱ:呼吸困难,点头呼吸;Ⅲ:腹肌痉挛,抽搐;Ⅳ:翻滚跌倒甚至死亡。出现上述症状即为造模成功。此时立即取出动物,置通风处,换气。同时记录引喘潜伏期(T),并进行比较。潜伏期:从吸入1%卵蛋白生理盐水溶液到腹肌痉挛、抽搐的时间。从第18天开始给药。模型组每天给予生理盐水10 ml/kg灌胃,中药低、中、高各组按规定剂量灌胃,阳性对照组按1 mg/kg体重腹腔注射给药,连续给药18天。并与给药后第6、12、18天分别诱喘1次,同时记录哮喘发作潜伏期。空白组以生理盐水替代卵蛋白同步实验。
1.2.3 标本采集 最后1次给药后24 h内,每只豚鼠称重后用3%戊巴比妥钠1 ml/kg注射,麻醉后腹主动脉放血处死。迅速选取右肺中叶于4%多聚甲醛(含1‰DEPC)中固定48 h后,常规石蜡包埋,切片,苏木精-伊红(HE)染色,光镜观察医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
迅速取火柴头大小的右下肺组织标本,用3%戊二醛固定,1%四氯化锇后固定,Epon-812树脂包埋,做超薄切片,醋酸铀、枸橼酸铅染色,透射电镜观察并照相。
1.3 统计学方法 所有数据均用x±s表示,SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析, P<0.05、0.01示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 健儿强身膏对哮喘豚鼠引喘潜伏期的影响 见表1。治疗后,哮喘模型组引喘潜伏期与治疗前比较未见明显差异。
2.2 肺组织病理变化观察 正常组:细支气管黏膜上皮排列整齐,细支气管壁内未见炎性细胞浸润,平滑肌周围偶见Eos(图1A1-2);哮喘组:细支气管黏膜上皮排列紊乱、增生明显,支气管黏膜及黏膜下层组织有大量的Eos、中性粒细胞浸润,支气管壁增厚,管腔狭窄,腔内有大量的上皮细胞脱落,组织黏膜充血水肿明显等典型的气道炎症表现(图1B1-2);地塞米松治疗组:组织黏膜仍有比较明显的充血水肿等,但Eos浸润较哮喘组豚鼠明显减轻,可见到淋巴细胞等,腔内有少量的上皮细胞和炎性细胞。(图1C1-2);健儿强身膏治疗组:与地塞米松治疗组相似,Eos浸润较哮喘组豚鼠明显减轻,可见淋巴细胞等,组织仍有充血水肿,腔内有少量的上皮细胞和炎性细胞。其中高、中剂量组支气管管腔扩大,肺泡间隔明显变薄,肺泡腔变大,肺泡区炎症细胞浸润明显减少(图1E1-2,1F1-2),中药低剂量组(图1D1-2)有所减轻。