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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：清洁级SD大鼠90只(山东绿叶制药厂动物中心)，雌雄各半，体重在200～220 g，月龄2～3个月。随机分为对照组(30只)、哮喘组(30只)，治疗组(30只)。
1.1.2 主要试剂和仪器：卵白蛋白(OVA, GradeV、II，美国Sigma公司)。RH123(美国Sigma公司)，淋巴细胞分离液(中国科学院天津试剂厂)，兔抗鼠Fas、FasL检测试剂盒(武汉博士德生物有限公司)，SABC试剂盒(武汉博士德生物有限公司)，JSCOK型单双通用水电分离式超声波雾化器(辽宁省鞍山市电子医疗仪器厂)，EPICS XL流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)，IMAGEPRO PLUS图像分析系统( 美国Media Cybernetics公司)。
1.2 方法
1.2.1 大鼠哮喘模型的建立:参照文献[3]的方法。实验组大鼠分别于实验第1天、第8天用新鲜配制的OVA( GradeV) 1 mg + 氢氧化铝200 mg + 生理盐水1 ml 混悬液在大鼠两腹股沟、腹部、前足跖4 个部位做皮下注射(每点0.2 ml),同时腹腔注射0.2 ml。于第15天,将大鼠置于20 cm×20 cm×15 cm大小的密闭容器中,用1%OVA 进行雾化吸入激发,每次雾化30 min ,连续7 d。对照组大鼠以等量的生理盐水代替卵白蛋白，同法、同量、同期进行致敏和激发，治疗组雾化吸入前30 min给予地塞米松2 mg/kg(生理盐水稀释为0.4 mg/ml)，每只每天腹腔注射。对照组、哮喘组、治疗组大鼠分别于激发后2、6、12、24、48 h 收集取淋巴液、BALF和血液分离淋巴细胞进行检测医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
1.2.2 大鼠淋巴液的采集：大鼠仰卧位，4%水合氯醛0.1 ml/kg腹腔注射麻醉，常规消毒。于剑突耻骨联合连线上2/3作腹部正中切口，将肠内容物移出腹腔，用温盐水纱布包裹。在右肾动脉水平，肠系膜上动脉处寻找肠系膜淋巴干。用留置针插入淋巴管，收集0.5 ml淋巴液。常规分离淋巴液中淋巴细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。
1.2.3 大鼠BALF、血液的收集：打开胸腔，充分暴露颈部,分离气管, 0号丝线结扎右主支气管。切开气管，行气管插管，固定，经气管行左肺支气管肺泡灌洗。用5 ml冷生理盐水分3次注入，约30 s后回收BALF，回收率高于80%。收集4 ml左右灌洗液4℃ 1 000 r/min，离心10 min，将沉淀细胞用1 ml PBS悬浮后，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。心脏穿刺取血，收集4 ml左右置于肝素离心管内，常规分离液分离淋巴细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。
1.2.4 流式细胞仪检测淋巴细胞线粒体跨膜电位：分离的淋巴细胞用PBS清洗2次,加入1ml的终浓度为1 μg/ml Rhodamine123放入37 ℃孵箱里静置培养45 min;PBS清洗2次,倾去原有液体;250 μl PBS重悬,缓慢加入-20 ℃乙醇750 μl;流式细胞仪检测(激发波长488 nm，发射波长525 nm)。
