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2.1腺病毒穿梭载体pAdTrackU6shRNA的构建和鉴定重组穿梭质粒pAdTrackU6shRNA经HindⅢ和Sal I双酶切后，用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定产生8300 bp大片段同410 bp的目的基因片段，经EcoRI单酶切后，由于pAdTrack多克隆位点外已有一个EcoRI的酶切位点，目的基因含有一个EcoRI酶切位点，因此重组穿梭质粒会被EcoRI切出约6000 bp和2670 bp大小的两条片段（图1)，进一步经测序鉴定U6shRNA已准确无误插入穿梭质粒pAdTrack.
1: marker DL2000; 2: pAdTrackU6NgR1shRNA被EcoRI单酶切; 3: pAdTrackU6NgR1shRNA被SalI HindⅢ双酶切; 4: pAdTrackU6NgR1shRNA; 5: marker λHind Ⅲ.
图1穿梭载体pAdTrackU6shRNA酶切鉴定
2.2重组腺病毒载体pAdEasyU6shRNA的构建和鉴定线性化的pAdEasyU6shRNA转化pAdEasy1感受态后，第18 h可观察到卡那抗性平板上均匀分布着大小不一的白色菌落，挑取体积较小的克隆抽提质粒后用PacI酶切，经8 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定，切出一条约33 000 bp大片段和一条约4500 bp的特征性小片段. 由于pAdEasy1不具有卡那霉素抗性而同源重组后形成的pAdEasyU6shRNA质粒获得了卡那霉素抗性，因此从卡那霉素抗性克隆中抽出的质粒经PacI鉴定后初步认定为重组成功的pAdEasyU6shRNA质粒. 质粒DNA重新转化Top10进行扩增，扩增后的质粒进行PCR鉴定，在约870 bp的特异性位置扩增出目的条带，质粒经Pac I酶切同样切出33 000 bp左右大片段和约4500 bp特征片段（图2)，证实pAdEasyU6shRNA质粒已重组成功.
1～3: pAdEasyU6shRNA被PacI单切;4: pAdEasyU6shRNA;5: pAdEasy1被PacI单切;6: pAdEasy1;7:marker λHind Ⅲ.
图2重组腺病毒载体pAdEasyU6shRNA酶切鉴定
2.3重组腺病毒的包装和扩增重组腺病毒转染293细胞24 h后荧光显微镜下即可见约10％的细胞有GFP表达，GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多，荧光增强，荧光斑点数增多，随后荧光斑点扩大，形成明显的噬斑，取适量鉴定正确的病毒上清重复感染293 细胞，扩增后收集病毒液（图3).
2.4腺病毒PCR鉴定重组空病毒可以扩增出约460 bp大小的片断，而带目的基因的重组病毒则可以扩增出约870 bp的片断，与设计相符，说明含U6shRNA基因的pAdTrackU6shRNA已与腺病毒核心基因组pAdEasy1发生了重组，并且重组腺病毒包装成功（图4).
2.5测序鉴定及滴度测定PCR产物测序结果同设计完全相符，证明我们成功构建了编码大鼠Nogo受体mRNA的shRNA特异性重组腺病毒载体. AdenoU6shRNA经繁殖、扩增后测定滴度，三条干扰片断NgR1，NgR2，NgR3腺病毒载体滴度分别为4.0×109，5.5×109，3.0×109 pfu/mL，阴性对照NgRHK滴度为4.6×108 pfu/mL.
A: 2 d; B: 4 d; C: 7 d; D: 病毒扩增.
图3重组腺病毒的包装及扩增
