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1～4:重组带目的基因病毒PCR结果; 5:重组空病毒PCR结果; 6～9: pAdEasyU6shRNAPCR结果;10:同源重组空质粒PCR结果; 11: marker DL2000医.学.全.在.线www.lindalemus.com.
图4pAdEasyU6shRNA及病毒DNA的PCR鉴定
3讨论
Nogo66受体NgR自发现以来［3］，引起了全世界神经科学家极大的兴趣，为人类深入研究髓鞘介导的神经再生抑制带来了新的契机，NgR已知是一个碱性磷酸酶（AP)熔合蛋白，它能高亲和性地与碱性磷酸酶及谷胱甘肽S转换酶（GST)蛋白结合并与Nogo66熔合. Nogo受体主要表达在CNS神经元及其轴突，并通过glycosylphosphatidylinositol（GPI)的一部分附着于浆膜的外小叶，表达于神经元的膜表面. NgR与其协同受体p75NTR［4］共同传递少突胶质细胞至神经元的抑制信号，因此，NgR在制约成年CNS损伤后的神经轴突再生中起着非常重要的作用. 髓鞘蛋白Nogo，OMgp和MAG共享NgR，表明NgR可能是神经生长中的一个至关重要的调控物质. Strimmater等［5］运用缩氨酸拮抗剂（NEP140)治疗脊髓损伤，以阻断髓鞘少突胶质细胞Nogo66与神经元 NgR的结合，其结果能有效地促进大鼠神经功能的恢复.
RNAi作为新兴的基因阻断技术，理论上可用于治疗任何由于单个基因高表达引起的疾病［6］. RNAi为双链RNA介导的基因转录后沉默，具有特异、高效等特点. siRNA为RNAi的关键效应分子，因此siRNA导入效率将是沉默成功与否的关键，制备siRNA的方法主要有体外化学合成和DNA载体细胞内表达siRNA. 化学合成siRNA对靶基因的抑制是瞬时的，质粒细胞内表达siRNA对靶基因的抑制也是暂时的；而应用病毒进行RNAi，可以感染不同细胞类型，可以提高siRNA转入细胞效率，既可以转染分裂细胞又可以转染静止细胞，还可以进行活体转染. 并于细胞内较长期介导siRNA抑制靶基因表达，其中腺病毒更具有感染细胞谱广、病毒滴度高、易于浓缩及贮存等优点［7-8］. 因我们拟将siRNA导入体外培养的海马脑片缺血模型中，但海马脑片培养属于原代培养，加之海马神经元属于终末细胞，于是普通质粒载体转染的效率受到抑制，因此构建siRNA重组腺病毒载体，通过重组腺病毒导入siRNA，可以提高转染效率，为进一步的RNAi研究提供了可行性保障.
【参考文献】
［1］ Woolf CJ, Bloechlinger S. It takes more than two to Nogo ［J］. Science, 2002, 297(5584): 1132-1134.
［2］ Yu JY,DeRuiter SL,Turner DL. RNAs interference by expression of short interferencing RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells ［J］. Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(9):6047-6025.
［3］ Fournier AE, GrandPre T, Gould G, et al. Nogo and the Nogo66 receptor ［J］.Prog Brain Res, 2002,137:361-369医.学.全.在.线www.lindalemus.com.
［4］ Wang KC，Kim JA，Sivasankaran R，et al．p75 interacts with the Nogo receptor as a coreceptor for Nogo．MAG and OMgp ［J］．Nature,2002,420:74-77.
［5］ McGee AW, Strittmatter SM. The Nogo66 receptor : Focusing myelin inhibition of axon regeneration ［J］. Trends Neurosci, 2003,26(4): 193-198.
［6］ DammWelk C, Fuchs U, Wossmann W, et al. Targeting oncogenic fusion genes in leukemias and lymphomas by RNA interference ［J］.Semin Cancer Biol,2003,13(4):283-292.
［7］ He TC，Zhou S，da Costa LT，et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses ［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(5)：2509-2514.
［8］ Sui G，Soohoo C，Affarel B，et al. A DNA vector based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(8)：5515-5520.
