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1 材料与方法
1.1 RNA提取、纯化及检测
WP3的培养选用海水培养基2216E(5g/L蛋白胨，1g/L酵母膏，0.1g/L磷酸铁，34g/L NaCL)。实验用差异显示引物见参考文献[4]，引物来自大肠杆菌基因组序列，其中反转录引物中含TTA，TCA等终止密码，而PCR引物中则含ATG起始密码，这样得到的每个产物都尽量包含起始和终止密码的开放阅读框。RNA提取按TRIzol方法进行(见MBI操作说明)，提取好的RNA样品要通过DNaseI(Takara公司，日本)处理以去掉残留的基因组DNA污染。
1.2 RAP_PCR建立及获得差异片段
RNA样品通过DNaseI处理去除基因组污染，然后用AMV反转录酶(Invitrogen公司，美国)42℃90min反转录。通过RAP_PCR扩增后，用质量分数8%的聚丙烯酰胺凝胶(通过尿素变性)电泳，用Scientific电泳系统(CBS公司，美国)1200W恒压电泳4h后至二甲苯砸青并到达玻璃板底部。寻找差异条带，将其小心用无菌刀片切割回收后95℃20min处理用作模板重新扩增，扩增得到的片段送至上海生工克隆测序。
1.3 差异片段的重新鉴定
选用RT_PCR，RNA点杂交，荧光实时定量PCR对有关差异条带进行重新验证。RT_PCR所用引物跟差异显示一样。RNA点杂交法：用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖纯化试剂盒纯化，纯化后一部分制备探针。准备好纯化的RNA，反转录合成cDNA，PCR检验cDNA质量合格后纯化，用地高辛标记(按试剂盒提供的方法检测标记效果)，取回收的电泳差异条带重扩增的PCR产物50ng，94℃变性5min，点样器将样品点到尼龙膜上，进行紫外交联，按25ng/mL取标记好的探针，在杂交炉杂交，随后进行免疫检测，检测所回收差异片段的真假。荧光实时定量PCR采用SYMBOL green I染料。所需引物经ABI软件引物设计软件[5]。
2 结果医.学.全.在.线www.lindalemus.com
第2期 李升康等.不同方法鉴定差异显示技术RAP_PCR得到差异基因的比较
2.1 RT_PCR验证中的看家基因
在做RT_PCR之前，需要找看家基因作为参比标准。通过RNA点杂交，发现pepN编码aminopeptidase N在不同盐浓度(质量分数1%、7%的NaCl 2216E海水培养基)和高盐浓度(质量分数20%的NaCl)刺激条件下为组成性表达(图1)。从后来的基因芯片杂交结果看，pepN在其他胁迫条件下的表达均无明显变化。因此，pepN可作为RT_PCR中的阳性对照。图1 pepN在不同胁迫条件下组成性表达
2.2 差异片段的重新验证
2.2.1 RT_PCR 为保证RT_PCR结果的可靠性，3次独立实验中提取的不同盐浓度RNA反转录作为模板。而对每个片段而言，又独立地作2次RT_PCR以保证结果的重现性。在随机选取的3个测序片段中，其中一个为假阳性。图2示以pepN为内对照，通过半定量RT_PCR发现其余2个为差异表达片段。图2 RT_PCR检测差异表达片段
2.2.2 RNA点杂交 以pepN为内对照，对Y1、Y2片段进行地高辛标记，与来自不同盐浓度生长菌体的RNA进行杂交，结果可见Y1和Y2在不同盐浓度中存在差异表达，其中Y1上调，Y2下调(图3)。图3 RNA点杂交验证差异表达片段
Fig.3 The detection of the differentially_expressed fragments by RNA dot hybridization
2.2.3 荧光实时定量PCR 首先优化了荧光实时定量PCR的扩增体系，分别检测Y1和Y2的扩增曲线和溶解曲线(图4、5)。通过荧光实时定量PCR实验表明，得到的差异表达片段是Y1表达上调3.598倍，Y2表达下调0.302(图6医.学.全.在.线www.lindalemus.com)。
3 讨论
