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1 材料和方法
1.1 细胞培养
大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52EA(中科院细胞库)，DMEM培养液(美国GIBCO公司),胎牛血清(Sigma公司),双抗(青、链霉素各100 U/mL)。每周传代2~3次。PTHrP、Ⅰ型胶原(美国Santa Cruz公司)，TGF-β1、MMP-2(英国ABCam公司),α-SMA(美国Dako公司),CM2H2DCF DA(美国Invitrogen 公司)
1.2 细胞分组与培养
NRK-52EA细胞分组为：⑴空白对照组(Control)：无糖培养基未进行干预;⑵正常葡萄糖组：含5 mmoL/L葡萄糖，DMEM培养基培养;⑶高糖组：含25 mmol/L葡萄糖，DMEM培养基培养;⑷间歇性高糖组:分别应用5 mmol/L葡萄糖(培养2 h)及25 mmol/L的DMEM培养基(培养3 h)交替培养，每天重复3次，夜间5 mmol/L葡萄糖维持过夜。所有分组均在37 ℃，5% CO2条件下培养3 d。
1.3 Western blot 检测蛋白表达
常规细胞裂解获取蛋白，与预染蛋白Marker一起上样,SDS-PAGE电离,电转印到PVDF膜上，TBST封闭，4 ℃过夜。然后与一抗分别按1∶100、1∶75、1∶125、1∶75及1∶50的比例室温孵育90 min(α平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原4 ℃，过夜)，再分别与辣根过氧化物酶标记相应二抗(1∶1 000)室温孵育45 min，TBST液洗膜，ECL显色。采用Total Lab分析软件对条带进行密度扫描分析。
1.4 活性氧(ROS)检测
各组细胞加入1 mmoL/L CM2H2DCF DA(终浓度为10 μmol/L)染色液10 μL,37 ℃避光孵育30 min,离心， PBS洗2次，重悬于含10%FCS的RPMI培养液中(1 mL)。酶标仪检测OD值,激发波长485 nm，发射波长528 nm。
1.5 统计学分析
采用SPSS 11.5软件进行统计学处理，One-Way ANOVA-SNK法比较总体和组间差异。
2 结果
各组细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP的表达见图1，其表达强度见图2，结果发现高糖及间歇性高糖组中TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP-2、α-SMA以及PTHrP的表达均高于空白对照组及正常葡萄糖组(各组间P<0.05);并且间歇性高糖组TGF-β1、MMP2及α-SMA表达要高于高糖组(P<0.05)医.学.全.在.线www.lindalemus.com。
图1 TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达电泳图(略)
不同葡萄糖条件下诱导NRK-52EA细胞株ROS含量影响,结果提示高糖及间歇性高糖均能显著促进ROS含量水平升高(4800.00±360.56，5933.33±585.95)(P<0.01)，而间歇性高糖升高ROS作用显著高于高糖组(P<0.05)。空白组(2036.67±212.21)和正常葡萄糖组(2070.00±257.62)均较前者低(P<0.01)
图2 TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达含量图(略)
3 讨论
近年来公布的数项世界范围大型糖尿病流行病学研究结果令人惊讶，早前英国糖尿病前瞻性研究(UKPDS)发现，单纯降低HbA1c并不能减少死亡率;而近年来ACCORD研究结果更进一步发现积极血糖治疗反而促进患者死亡率升高，该一系列研究结果与研究设想完全相斥。许多研究者认为，其主要原因可能由于积极血糖控制所导致血糖的波动致间歇性高血糖反复出现，比单纯持续性高糖更加危害机体机能。糖尿病肾病是最常见的糖尿病慢性微血管并发症，是糖尿病患者死亡的最重要因素之一，而所有糖尿病肾病病理转归即是肾脏纤维化。为此，本研究将从体外实验去揭示间歇性高糖与肾脏纤维化之间可能的联系，以进一步阐明间歇性高糖与持续性高糖间对机体危害的差异。
