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1.2 膜片嵌全细胞记录
采用标准式全细胞记录。将内冲过电极内液的玻璃微电极(尖端1～2μm，阻抗2～5MΩ)连接于电极支持装置，取上述制备好的心肌细胞悬液数滴滴于灌流槽中，置于生物倒置显微镜下(Olympus，日本)，待细胞沉底附壁后，用钠灌流液灌流，灌流速度2mL/min，冲去死亡细胞碎片，选取表面光洁、横纹清晰的心肌细胞作为研究对象。采用三维液压微操纵器靠近细胞进行封接，封接阻抗1GΩ以上，吸破细胞膜形成全细胞记录模式。脉冲信号由Digidata 1320A(美国Axon)放大器控制，数据由pClamp8软件采集、分析。数据经计算机自动分析后储存于计算机硬盘中。
1.3 药品与试剂
雷诺嗪(CV Therapeutics公司，美国)，胶原酶Ⅰ、蛋白酶、EGTA、HEPES均为Sigma公司产品。试剂的配制：①无钙台氏液(mmol/L)：NaCl 125、KCl 3.5、K2HPO4 1.5、MgCl2 1、NaHCO3 20、HEPES 5，用NaOH调节pH至7.4;②KB液(mmol/L)：L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 80、K2HPO4 20、KCl 20、MgCl2 5、K2EGTA 0.5、Na2ATP 2、丙酮酸(Pyruvic Acid) 5、肌酸(Creatine)5、牛磺酸(Taurine) 20、甘氨酸(Glycine) 10、HEPES 5、Glucose 10，用NaOH调节pH至7.3;③INa电极内液(mmol/L)：NaCl 10、CsF 110、CsCl 20、EGTA 5、HEPES 5、ATP-Mg 5，用CsOH调节pH至7.4;④钠灌流液(mmol/L)：CsCl 130、MgCl2 1.0、NaCl 10、CaCl2 1.0、HEPES 5、Glucose 10、CdCl2 0.3 用CsOH调节pH至7.4。所有实验在室温(20～25℃)下进行。
1.4 统计学处理
采用细胞外给药的方法，给药后5min观察指标的变化。所有统计学处理均应用SPSS11.5软件包进行。计量资料以±s表示，实验在同一细胞进行，用自身对照t检验进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 雷诺嗪对INa的影响
维持电压(holding potential)在-100mV，指令电压-80mV～+40mV，步长20mV，钳制时间80ms，刺激频率0.5Hz，引出INa;以不同钳制电压下的电流密度绘成电流-电压(Ⅰ～Ⅴ)关系曲线，然后给予30μmmol/L雷诺嗪灌流5min，重复上述操作。30μmmol/L雷诺嗪可显著抑制INa的峰电流，INa电流密度峰值(钳制电位-40mV时)由灌流前的(33.42±4.33)pA/pF(n=6)降至灌流后的(13.4±4.43)pA/pF(n=6，P<0.01)，其IC50为(25.6±1.8)μmmol/L(图1)。
2.2 雷诺嗪对INa-T的频率依赖性和使用依赖性
INa的使用依赖性测定：保持电位从-100mV～-40mV，给予1Hz、3.3Hz和5Hz不同刺激频率(刺激间期分别1000ms、300ms和200ms)，脉宽10ms，脉冲20个。3种刺激频率在同一细胞完成，给予不同刺激频率时时间隔2min。结果显示，30μmmol/L雷诺嗪灌流后，3.3Hz连续20个脉冲所产生的INa电流呈逐渐减少趋势，最后达稳态水平(图2A);随着刺激频率的增加对INa电流阻断也加大，说明存在使用依赖性(图2B);随着药物浓度的增加和刺激频率的加大对INa电流的阻断逐渐加强(图2C);随着刺激频率的增加对INa电流阻断IC50逐渐减少，说明该药亦存在频率依赖性(图2D)医.学全.在.线www.lindalemus.com。
3 讨 论
