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亚砷酸(主要成分为As2O3)购自哈尔滨伊达药业有限公司;TUNEL凋亡试剂盒购自德国Roche公司;兔抗人Fas和FasL多克隆抗体均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品;人胃癌SGC7901细胞购自第四军医大学实验动物中心。
1.2 人胃癌裸鼠移植瘤模型的建立和分组
30只BALB/C-nu/nu裸鼠，雄性，5周龄，体重19～21g，在SPF条件下饲养。在无菌条件下，每只裸鼠于右后肢背部皮下注射4×106个人胃癌SGC7901细胞(0.2mL)，接种10d后，裸鼠均形成瘤节。随即将30只裸鼠随机分为对照组及As2O3低、高剂量治疗组3组。As2O3低剂量组和高剂量组分别按2.5mg/kg和5mg/kg剂量给予As2O3腹腔注射治疗;对照组给予等体积生理盐水。连续给药10d。
1.3 抑瘤率的计算
于给药第0、6、11天分别测量瘤块的长径(a)、短径(b)，瘤块体积(cm3)=1/2ab2，抑瘤率=(1-治疗组瘤块平均体积/对照组瘤块平均体积)×100%。同时留取各组的肝、肾组织。
1.4 组织标本的制备和电镜观察
治疗结束次日，每组取2只裸鼠，每只裸鼠腹腔注射1g/L戊巴比妥钠进行麻醉，用刮胡刀片从每个瘤块中游离出体积约1mm3的瘤组织，放入25g/L戊二醛中固定，供电镜用。所有裸鼠取出瘤组织，放入40g/L多聚甲醛溶液中固定，制备冰冻切片供TUNEL法检测凋亡用，制备石蜡切片供HE染色或免疫组化检测Fas/FasL用;取出裸鼠的肝、肾放入40g/L多聚甲醛溶液中固定，制备石蜡切片供HE染色用。
按常规透射电镜制样方法固定、包埋和染色，于H-600型透射电镜下观察细胞凋亡情况并拍照。
1.5 TUNEL法检测细胞凋亡情况
严格按试剂盒说明书步骤进行。结果判定：Leica激光显微镜下、515～565nm绿光观察，每个样本在凋亡细胞较集中的区域(凋亡热区)取10个400倍视野，用Leica Confocal软件测量其荧光强度，该10个视野荧光强度的平均值分别为每个样本的荧光强度值。
1.6 免疫组化法检测Fas、FasL蛋白的表达
按SP免疫组化染色试剂盒说明书操作。结果判定：每个样本在Fas/FasL高表达区域取10个400倍视野，用Leica图像信号采集与分析系统测量其灰度，该10个视野灰度的平均值分别为每个样本的灰度值。
1.7 统计学处理
应用SPSS10.0统计软件处理数据，计量资料数据采用均数±标准差表示。多样本均数比较采用完全随机设计的单因素方差分析，各组均数间两两比较用Student-Newman-Kewls法。P<0.05为差异有统计学意义医.学全.在.线www.lindalemus.com。
2 结 果
2.1 裸鼠移植瘤的生长情况及As2O3的抑瘤率
30只裸鼠在接种胃癌细胞10d后均形成结节，全部成瘤。给药前3组间瘤块的平均体积没有显著性差异(P>0.05);给药第6天3组间瘤块的平均体积仍然没有显著性差异(P>0.05);给药第11天(治疗结束次日)两个治疗组瘤块的平均体积均显著小于对照组(P<0.05)，且高剂量治疗组显著小于低剂量治疗组(P<0.05，表1);用瘤重来计算得到同样的结果。治疗组与对照组相比，裸鼠的肝、肾组织无明显病理损害。表1 As2O3对裸鼠皮下移植瘤的抑制作用(略)与对照组比较，^P<0.05;与As2O3低剂量组比较，△P<0.05。
2.2 透射电镜下肿瘤细胞的凋亡情况
对照组呈典型的瘤细胞表现，瘤细胞大小不一，形态不规则，胞核较大，多核仁，核仁大小不一，核仁有不居中现象甚至边集;凋亡细胞极少见。低剂量治疗组可见凋亡细胞，但比高剂量治疗组少，且典型的“凋亡小体”极少见;高剂量组可见较多的凋亡细胞，染色质浓染边集，有的正在或已经被周围的细胞所吞噬，凋亡细胞集中的区域可见典型的“凋亡小体”。治疗组可见典型的坏死细胞(图1)。
2.3 TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡情况
激光共聚焦显微镜下(400倍)，被荧光着色的是凋亡细胞。治疗组尤其是高剂量组凋亡细胞较多，对照组凋亡细胞较少，且凋亡细胞有集中分布现象(图2)。采用LeiCa Confocal软件定量分析3组肿瘤凋亡细胞的荧光强度。结果显示，对照组的荧光强度为12.49±3.22，2.5mg/kg As2O3组和5mg/kg As2O3组的荧光强度分别为25.74±3.82和85.39±8.92，对照组分别与治疗组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。表2 As2O3治疗组和对照组Fas、FasL表达的比较(略)与对照组比较，^P<0.05;灰度值越低说明表达越高。
