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1 材料与方法
1.1 主要试剂
新生牛血清购于杭州四季青生物;低糖DMEM培养基购于Gibco公司;Ⅰ型胶原酶。Ⅱ型胶原酶购于Sigma公司;Trizol。DEPC 。RT-PCR试剂盒。Pfu高保真聚合酶。琼脂糖。DNA回收试剂盒。DNA标准Marker。质粒小提试剂盒。病毒DNA提取试剂盒均购于Takara(大连)公司;入门载体试剂盒(含TOP10感受态菌)。表达载体pAD/CMV/V5-DEST(含293A细胞)。LR ClonaseTM 酶购于Invitrogen公司;内切酶NotⅠ。AscⅠ。PacⅠ均购于NEB公司。MSC诱导药物地塞米松。胰岛素。β磷酸甘油。IBMX。维生素C。吲哚美辛购于Sigma公司,染色试剂油红O。茜素红购于AMRESCO公司,免疫组化用一抗兔抗大鼠Ⅰ型胶原,兔抗大鼠骨钙素。二抗羊抗兔IgG及 SABC试剂盒均购于武汉博士德公司;兔抗大鼠LMP-1抗体购于美国Santa Cruze公司;碱性磷酸酶Elisa检测试剂盒。骨钙素Elisa检测试剂盒均购于武汉华美生物公司。
1.2 大鼠LMP-1基因的获取
1.2.1 大鼠成骨细胞的分离与体外培养以及鉴定
取SD乳鼠两只放入750 mL/L酒精中浸泡10 min。无菌取颅盖骨,置于含PBS液的培养皿中,尽量剔除附着的血管及结缔组织,PBS液清洗,再将颅盖骨剪成1 mm × 1 mm碎块,转移到50 mL离心管中,1 g/L胶原酶(Ⅰ型:Ⅱ型 = 1:6)消化液37 ℃水浴消化20 min,并每隔2 min摇晃震荡一次,共消化4次,分别取后两次消化液转移至15 mL离心管予以250 × g离心10 min,弃去上清液,沉淀即为成骨细胞,用含100 mL/L新生牛血清的L-DMEM培养液重悬,吹打均匀至单个悬细胞,按1 × 105/mL密度接种到25 cm2培养瓶中,37 ℃。50 mL/L CO2。饱和湿度下培养,传代。
1.2.2 大鼠成骨细胞总RNA的提取 取2代大鼠成骨细胞将培养液换成含1 nmol/L地塞米松和100 mL/L胎牛血清培养液(L-DMEM)诱导培养一周[1],当细胞融合近90%后,吸弃培养液,PBS冲洗两次,按照Trizol説明书进行细胞RNA提取,每只25 cm2 中加入Trizol液1 mL,最终所得的RNA利用30 μL的DEPC水溶解,并对其进行琼脂糖凝胶电泳和分光光度检测,其余的RNA置于 -80 ℃冰箱保存。按D(260) = 1的RNA溶液每mL约含40 μg RNA来估算所得到RNA的浓度,根据在260 nm以及在280 nm的读数间的比值D(260)/D(280)估计核酸的纯度。
1.2.3 RT-PCR获取与扩增LMP-1基因 RT-PCR利用TAKARA RT-PCR试剂盒进行两步法反应:第一步反应体系选用Oligo引物,按照试剂盒説明书依次加入反应体系于100 μL PCR管中,置于PCR仪中45 ℃,25 min,然后95 ℃,10 s使逆转录酶变性,得到的cDNA用于PCR,剩余可保存于 -20 ℃。第二链合成中引物根据Genebank中大鼠LMP-1基因利用Primer 5软件设计而成:正义引物:5′-CACC ATGGATTCCTTCAAGGTAGTGC-3′,反义引物:5′-GGGCTTGTCCTTCTTGGAGTAG-3′,其中CACC是目的基因与入门载体之间的接头,并且框中结构形成Kozak序列,有助于增强目的基因的表达[2],预计合成1 341 bp的产物。大鼠GAPDH内参引物:正义:5′-CAGTGCCAGCCTCG TCTCAT-3′,反义:5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′,预计合成571 bp的产物。聚合酶采用TAKARA高保真酶,采用50 μL反应体系进行30个循环反应(98 ℃,10 s;56 ℃,10 s;72 ℃,1 min 25 s),最后延伸7 min后收集产物进行电泳鉴定,并利用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收,测D值进行浓度分析。
1.3 LMP-1重组腺病毒载体的构建
1.3.1 LMP-1与入门载体pTREN-TOPO构建入门克隆 根据纯化目的基因的浓度进行6 μL的TOPO反应体系:PCR纯化产物0.5 μL。盐溶液1 μL。入门载体1 μL。无菌水3.5 μL,轻轻混匀,室温(约25 ℃)静置5 min后冰浴10 min,取2 μL TOPO反应产物进行转化TOP10感受态大肠杆菌,最后涂在含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板进行筛选,平板置于37 ℃恒温培养箱16 ~ 24 h后观察阳性克隆。无菌操作下挑取单个阳性克隆置于含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基4 mL置于37 ℃,水平转速为250 r/min的恒温摇床摇菌8 h,按照质粒提取试剂盒説明操作进行质粒提取,并对提取的质粒分别进行NotⅠ。AscⅠ单酶切和双酶切鉴定。
