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2.1 成骨细胞的分离。培养和初步鉴定
成骨细胞接种后24 h后即可见大量贴壁细胞,细胞呈长梭型,多角形或不规则型,48 h后可见细胞融合70% ~ 80%。
2.2 成骨细胞的总RNA提取
总RNA后电泳结果显示:可见18S和28S两条条带,亮度28S:18S ≈ 2:1,初步表示所提RNA完整。分光度测定结果:D(260) = O.473,D(280)= 0.233,D(260)/D(280) = 2.03,表示所提RNA纯度符合要求(图1A)。
2.3 RT-PCR获取与扩增LMP-1基因
取目的与内参PCR产物各5 。滋L进行电泳(图1B)。
2.4 入门克隆的酶切鉴定
入门克隆的酶切鉴定结果见图2。
2.5 病毒质粒载体与测序结果
病毒表达质粒送于上海英俊生物公司测序,并与Genebank中LMP-1(基因号:AF095585)做BLAST比较,发现系列一致,没有突变。
2.6 病毒载体在293A细胞中的包装
按照前述条件转染,8 d后293A细胞出现约100%CPE(细胞病毒效应),细胞感染病毒后,用病毒上清提取病毒DNA为模板,以前述目的基因引物为引物作PCR检测,电泳可检测出目的条带,説明病毒液中含有目的基因(图3)。
2.7 全骨髓细胞培养
3 d后可见少量长梭形贴壁细胞,半量换液,1周后可见MSC贴壁集落形成,细胞疏密不均,9 d后予以传代,第2代MSC呈长梭形。纺锤形生长,形态仍不均1,3代MSC呈长梭形,漩涡状生长,形态较为均一。将第3代MSC进行成骨成脂诱导4周后进行茜素红以及油红O染色,分别可见矿化结节以及脂滴阳性显色。将第3代MSC进行流式细胞仪检测,可见CD29+ 约96.27%;CD44+ 约99.51%;CD105+ 约90.38%;CD45- 约96.08%。
2.8 转染后培养液中碱性磷酸酶测定
分别收集转染1周后,2周后各组各孔的培养液,利用ELISA方法测定ALP含量,发现个转染组在1周末,2周末的ALP,含量均高于对照组,经过方差分析统计比较,F值分别为:106.19和9.92,均P < 0.01,差异具有统计学意义;SNK两两比较,发现除E组,F组差异比较没有统计学意义,其余各组相互比较均具有统计学意义,即表明当转染MOI = 10具有最强的诱导碱性磷酸酶活性作用。
2.9 转染后骨钙素的测定
收集各组各孔1周后,2周后的培养液,利用ELISA法测定骨钙素含量,发现各组比较情况与ALP类似,方差分析结果,F值分别为:114.88和193.15,均P < 0.001,各组差异具有统计学意义;两两比较,E组,F组,以及两周末的B组与D组差异比较没有统计学意义,其余各组相互比较均具有统计学意义,表明转染MOI = 10时具有最强的诱导骨钙素表达作用,与上述碱性磷酸酶一致(表1,2)。
2.10 免疫组化
显示转染2周后组骨钙素,Ⅰ型胶原的表达明显高于对照组,3周后茜素红染色显示矿化结节染色明显,结果显示见图5 A-D。
2.11 Western-blot检测
LMP-1基因在MSC中的表达,可见转染组表达的浓度显著高于对照组(图6)。
3 讨 论
由于骨质疏松(osteoporosis, OP)患者成骨能力低下,骨折手术失败率高,愈合缓慢甚至不愈合[2],OP骨折的治疗多年以来一直是困绕骨科临床医生的难题之一。基因治疗骨质疏松骨折目前仍是一个有待开垦的崭新领域。MSC的生物学特性表明它能作为基因治疗理想的靶细胞和载体,LMP-1作为细胞内的蛋白不仅能高效地诱导骨的形成,更能刺激多种骨诱导因子(包括BMPs。TGF-β1等)的分泌,为骨折的修复提供非常有利的环境。因此选择LMP-1作为载体,以MSC作为基因治疗的靶细胞,LMP-1 cDNA转染MSC,促进MSC增殖和成骨细胞分化,提高MSC的成骨活性,用含LMP-1cDNA的MSC治疗OP骨折。是对基因治疗OP骨折这种新方法和途径的探索。
骨诱导因子大多是细胞外分泌型因子,是由细胞外蛋白或是由传递细胞间信号的多肽构成,如BMP等。与BMP不同, LMP-1是细胞内因子,作为细胞内信号分子,它能于体内。体外启动骨的形成。LMP-1不是分泌型因子,它是能刺激其它骨诱导因子合成和分泌的细胞内蛋白。表达LMP-1的细胞能合成和分泌多种不同骨诱导因子(包括BMP。TGF-β1等),同时招募临近的细胞分化并直接参加骨膜或软骨内成骨[1],这样也就为成骨能力低下的疏松骨组织提供了非常有利于骨形成的环境。动物以及体外实验表明,使用非常小剂量的腺病毒或质粒载体转染LMP-1 cDNA的骨髓细胞,能持续高效地诱导骨形成,促进脊柱的融合。CT扫描还显示表达LMP-1细胞的存在增加了融合块的密度并使载体边界有更多的骨形成[3-5]。国内外关于骨诱导因子促进骨形成的大多数研究都集中在BMP上,关于LMP-1的研究相对较少[6]。研究的对象主要为骨缺损的修复以及脊柱的后路融合,途径为转基因技术和重组蛋白应用。研究结果表明,两种方法均能促进骨的形成,但基因治疗较重组蛋白必要时能提供更持续的蛋白释放,而且能以更符合生理要求的方式提供蛋白[7]。重组蛋白诱导的新骨不规则地填充于骨折端的边缘,骨小梁比较脆弱,象壳一样围绕骨缺损处;转基因诱导的新骨为坚实的三维骨小梁结构,并重建形成新的骨皮质[8]。与BMP不同,LMP-1为细胞内信号分子直接刺激成骨细胞的分化,并刺激其它骨诱导因子合成和分泌,因此治疗性应用LMP-1,其基因cDNA的转染是必须的。也是最好的途径[4]。LMP-1在体内外高效的成骨作用是我们选择其作为治疗骨质疏松及其骨折候选基因的主要原因。
腺病毒是目前转基因实验研究中使用最多的病毒载体。目前大多采用Adeasy系统来构建和包装腺病毒载体。本试验采用了Invitrogen公司的GatewayTM技术进行病毒载体构建,首先将目的基因进行TOPO定向克隆至入门载体,然后利用入门载体克隆与病毒骨架在体外进行同源重组,将目的基因转入病毒骨架,转化筛选,整个过程只需两步。这项技术的特点是只需设计引物时在目的基因前加上CACC接头,PCR产物即可利用接头与入门载体pENTR/D-TOPO进行TOPO定向克隆,5 min即形成入门克隆,再转化细菌筛选阳性克隆,由于入门载体自身是线性,只有在TOPO克隆成功才能与目的基因连接成环状,完成滚环复制,因此所得阳性克隆特异性高。入门克隆获取后可利用同源位点和表达载体pAD/CMV/V5-DESTTM在体外进行同源重组反应,只需6 ~ 8 h并可转化细菌筛选重组子,同时由于表达载体含有自我死亡基因ccdB,重组后被目的基因替代,没有重组成功的表达载体自然死亡,重组子的特异性也相对特异较高。除了用来鉴定外,构建过程中不需要酶切反应,不需要蓝白菌落筛选,整个构建过程操作相对简单。快捷。本实验结果表明,利用GatewayTM技术构建LMP-1重组腺病毒载体不仅大大简化了基因克隆的步骤,而且显著提高了克隆效率。获得的pAd-LMP-1可进一步用于基因治疗理想的靶细胞的转染,构建骨质疏松症及其骨折的基因治疗的细胞载体。
