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医学论文范文:人前脑啡肽原绿色荧光蛋白真核表达载体的构建
【摘要】 目的 构建人前脑啡肽原(preproenkephalin,PENK)绿色荧光真核表达载体并进行鉴定。方法 参照PENK基因全序列，在cDNA两端各设计一条对应引物，并引入各自酶切位点。通过RTPCR的方法从正常人脑组织中扩增出目的基因，并定向克隆至pEGFPC3绿色荧光蛋白真核表达载体上。筛选阳性克隆，通过双酶切和测序法鉴定重组质粒。结果 双酶切结果与目的基因表达的条带完全吻合，克隆测序结果与NCBI收录的PENK序列完全一致。结论 成功构建pEGFPC3PENK载体，为进一步研究疼痛的基因治疗奠定基础。
【关键词】 绿色荧光载体;真核表达;人前脑啡肽原
Construction of Human PENK and Green Fluorescent
Protein Eukaryotic Vector
LI Yonghui, HU Yile, TU Xinming, et al
(Medical College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)
Abstract:Objective To construct and identify the human PENK and green fluorescent protein eukaryotic vector. Methods To correspond to the PENK gene sequences, introduce respective restriction sites in each end of cDNA; and obtain the target gene from the normal tissue of brain by RTPCR, then connect the target gene to the pEGFPC3 green fluorescent protein eukaryotic vector; and choose the positive clones to identify the recombinant plasmids by double disgestion and sequencing. Results Double disgestion results and the expression of target gene band matched completely; the clone sequencing results were the same as the sequence of PENK contained in NCBI results. Conclusion pEGFPC3PENK vector is successfully constructed for the further study of the gene therapy of pain.
Key words:green fluorescent vector;eukaryotic expression; PENK
癌症晚期病人的疼痛治疗是目前医疗界的一项难题，传统的阿片类镇痛药物虽有较好的效果，但由于其具有成瘾性、呼吸抑制等副作用限制了在临床上的使用[1]。20世纪80年代以后，基因技术的快速发展为疼痛的基因治疗开辟了一个新时代 [2，3]。脑啡肽[4，5]是机体自身合成的一种内源性阿片肽，无阿片类药物的副作用且有较好的镇痛作用，目前已经成为疼痛研究的一个新方向。本实验将人体内控制脑啡肽合成的前脑啡肽原基因与pEGFPC3载体连接，构建成前脑啡肽原绿色荧光真核表达载体，为进一步研究疼痛的基因治疗奠定了基础医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
1 材料与方法
1.1 脑组织来源 取自郑州大学第一附属医院因颅脑外伤意外死亡患者的脑组织(死亡0.5 h内)。
1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒cDNA 第一链合成试剂盒、DNA Marker、DNA胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶均购于大连宝生物公司;JM109菌、pEGFPC3质粒由郑州大学基础医学院人体解剖学实验室保存;PE4800型PCR仪产自美国PE公司;722型电泳仪、水平电泳槽产自上海医疗器械厂;其他普通试剂购于国内各大试剂公司。
1.3 总RNA的提取 无菌条件下取出脑组织，按照大连宝生物公司的总RNA提取试剂盒说明书操作，具体步骤如下：①在超净工作台中取脑组织，在冰盒上切成约100 mg的小块，置于1.5 mL离心管中及时使用或-80℃冻存备用。②取一块100 mg的脑组织置于研磨器中加入液氮迅速用力研磨3～5次。③加入450 μL RLT solution，用力晃动或用枪头吹打使其混匀，充分裂解后将裂解液吸入RNasefree的EP管中，在56℃水浴3 min。④水浴完成后加入250 μL的无水乙醇。⑤取700 μL的样品放于2 mL收集管中的过滤柱中。置于低温离心机中4℃ 8 000 r/min离心1 min。⑥倒去收集管中的废液，加入500 μL的RW solution于柱中，静置1 min，置于4℃低温离心机中10 000 r/min离心1 min。⑦倒去收集管中的废液，加入500 μL的RPE solution于柱中，置于4℃低温离心机中10 000 r/min离心1 min，重复⑤1次。⑧倒去收集管中的废液，置于4℃低温离心机中10 000 r/min离心15 s。⑨将滤柱放入无菌的RNasefree的1.5 mL离心管中，加30～50 μL DEPCH2O到柱膜中央，在50℃恒温水浴锅中放置2 min，置于4℃低温离心机中10 000 r/min离心1 min，收集，分为10 μL/管，-70℃冻存或立即使用。
1.4 RTPCR 根据GenBank报道的人前脑啡肽原基因序列, 使用Primer5.0设计引物，上游和下游引物分别加上HindⅢ和BamHI的酶切位点，
