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F：5ˊGAAAAGCTTATGGCGCGGTTCCTGACA3ˊ
R：5ˊGCCGGATCCTTAAAATCTCATAAATCCTC 3ˊ通过RTPCR扩增PENK目的基因。总RNA先70℃变性5 min，冰浴冷却后加入反应体系，反应物总体积为20 μL，离心混匀后，置于42℃恒温水浴锅中水浴1 h，然后移至70℃水浴5 min灭活反转录酶，产物为人脑组织的总cDNA。反应结束后，取PCR反应液5 μL进行1%的琼脂糖凝胶电泳，观察PCR的扩增产物。
1.5 TPENK载体的构建 利用胶回收试剂盒将PCR产物的DNA目的片段纯化回收，将回收片段与T载体连接，转染大肠杆菌 JM109，通过菌落PCR鉴定阳性克隆，对阳性克隆扩大培养提取TPENK重组质粒。
1.6 pEGFPC3PENK真核表达载体的构建及鉴定 按1∶3比例将TPENK载体和pEGFPC3载体混合后用HindⅢ和BamHI双酶切成线状并经电泳回收，混合后16℃连接过夜，连接产物用42℃水浴热击法转入JM109感受态细菌内铺含Amp+的琼脂平板，倒置37℃培养12～16 h，通过菌落PCR和酶切法鉴定阳性克隆，并取PCR阳性克隆菌送上海生物工程公司测序。
2 结果
2.1 人前脑啡肽原基因的克隆 通过RTPCR法扩增出的PENK基因与预测的基因基本一致(见图1)。
1：Marker 2：针对pEGFPC3设计的引物所扩PENK基因
图1 人前脑啡肽原基因的PCR电泳图
2.2 重组质粒的双酶切鉴定与测序结果 从图2中可以看出，酶切出约800 bp(PENK)和5 000 bp (pEGFPC3)的DNA片段。与理论计算一致，命名为pEGFPC3PENK。测序结果与GenBank报道的序列完全吻合，载体构建成功医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
1：Marker 2、3：酶切新载体所得PENK和pEGFPC3片段
图2 构建新载体的酶切电泳图
3 讨论
疼痛治疗是医学界的长期研究课题。目前缓解疼痛的主要治疗药物仍是阿片类药物，其成瘾性和毒副作用大等特点又使其临床应用受限。脑啡肽是一种神经递质，阿片受体的内源性配体,通过阿片受体介导的抑制腺苷酸环化酶、抑制磷脂酰肌醇水解等细胞内信号传导途径发挥作用。脑啡肽包括甲硫氨酸脑啡肽(MEK)和亮氨酸脑啡肽(LEK)具有镇痛效果好、副作用少的优点，但脑腓肽易被脑啡肽酰A或B降解成无活性的衍生物，因此找到一种持续分泌内源性脑啡肽，且具有临床可行性的方法，成为研究的主要方向。前脑啡肽是脑腓肽的前体,在翻译过程中经不同的蛋白酶降解形成上述两个具有镇痛作用的活性阿片肽。前脑啡肽源基因是慢性疼痛基因治疗中一种较为理想的基因选择，是目前国内外研究的热点。杨茂元等[6]先用在脂质体介导下将人前脑啡肽源基因(human preproenkephalin，HPPE)转染鼠成纤维细胞系NIH/3T3细胞，然后将该细胞移植入大鼠的蛛网膜下腔进而评价神经性疼痛治疗的效果，结果表明成纤维细胞系NIH/3T3能表达β内啡肽基因，HPPE作为转基因镇痛治疗难治性疼痛是可行的。基因镇痛研究中常用的载体有病毒载体与非病毒载体，病毒载体携带外源基因和相关基因元件，并被包装成病毒颗粒可整合入不能分裂增殖神经元细胞内进行表达。在体内外实验中使用较多，但其来源于病毒存在自身免疫原性和造成细胞病理改变等特性，其临床应用也受到限制[7]。而非病毒基因载体则以其设计灵活、低免疫原性、低毒性、低致癌性、外源基因整合几率低、无基因插入片段大小限制、易制备、长期表达等优点，成为基因治疗新选择。在国内华中科技大学徐颖等[8]人，将前脑啡肽基因连接到真核载体上，利用逆转录病毒四环素调控系统,建立四环素调控表达人前脑啡肽原基因的大鼠星形胶质细胞系，将来移植到体内，可依据疼痛程度，调控疼痛基因表达时间与水平，这使得基因治疗与临床应用又近了一步。
