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1.1 实验动物、试剂和仪器
一月龄新西兰兔;小鼠成纤维细胞NIH3T3(美国迈阿密大学外科实验室);DMEM培养基(Hyclone公司);小牛血清(杭州四季青生物技术材料研究所);胰蛋白酶(Sigma公司);多聚季胺(polybrene)储用液(8g/L)(Sigma公司);G418储用液(50g/L)(GIBCO/BRL);CO2培养箱、无菌超净台、离心机、倒置显微镜。
1.2 细胞株和质粒
人293T细胞、293/GPG包装细胞系由余红博士馈赠;pCnBgSN[3]是lacZ基因的表达质粒;质粒pHIT60[4]是鼠白血病逆转录病毒(murineleukemia retrovirus, MuLV)Gag和Pol蛋白的表达质粒;质粒pCVG[2]是疱疹性口炎病毒G糖蛋白(vesicular stomatitis virus G glycoprotein, VSVG)的表达质粒。所有质粒由美国迈阿密大学外科实验室余红博士提供。所有质粒DNA均用大肠杆菌DH5α感受态细胞(TIANGEN BIOTECH)扩增，并用试剂盒(Valencia, CA)从大肠杆菌中提取。
1.3 方法
1.3.1 SMC的分离培养
一月龄大耳白兔用水合氯醛腹腔注射麻醉后，在无菌条件下，迅速将颈内静脉取出，盛入有PBS液的平皿中。洗净血块，剥除外膜，将血管翻转内膜面朝外，用刀片自上而下刮1～2遍，去除VEC。然后用显微镊撕下血管中膜的平滑肌层，将其剪碎(0.5～1mm3)，接种于培养瓶中，在CO2培养箱中放置2.5～3.0h，使组织块较牢固地黏附于瓶壁，加入含200mL/L新生牛血清的DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM, Gibco)培养液，3～4d更换培养液一次。细胞生长形成致密单层时，用1.25g/L胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代培养，5～6d可继续传代一次[5]。实验采用第2～4代细胞进行研究医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
1.3.2 小鼠成纤维细胞(NIH3T3)的培养
含100mL/L灭活胎牛血清(杭州四季青生物制品研究所)，2mmol/L谷氨酰胺，100mg/L青霉素及100mg/L链霉素的DMEM培养液，置37℃，50mL/L CO2，饱和湿度的CO2培养箱中培养，隔天半量换液，细胞为对数生长期，存活细胞百分率95%(台盼蓝拒染法)，备用。
1.3.3 两型逆转录病毒的生产
MuLV及MuLV/VSVG载体均参考三个质粒短暂转染体系[3]方法生产，二者均含有β2半乳糖苷酶报道基因。293T/17细胞(美国迈阿密外科基因实验室冻存，1×106个细胞/10cm直径培养皿)。采用改良磷酸钙沉淀转染法。MuLV加入质粒DNA pCnBgSN，pHIT60和pCAE各10μg;MuLV/VSVG则加入质粒pCnBgSN，pHIT60和pCVG各10μg，转染16h后将细胞培养液更换为含有10mmol/L sodium butyrate(Sigma)的培养基，12h后，以6mL新鲜培养基替换原培养基，以生产病毒，培养12h后，收获含有病毒颗粒的上清，0.4μm的滤器过滤后分装，-70℃保存，备病毒滴度测定及转导。
1.3.4 VSVG/MuLV浓度的测定
采用G418克隆筛选法[6]：①第1天，将NIH3T3细胞放入30mm的六孔板中(5×104细胞/孔);②第2天，将病毒上清液与多聚季胺混存(终浓度为8mg/L)，滴度测定时以含有多聚季胺的DMEM培养液以1∶10梯度稀释上清，循六孔板以1～6孔序号形成10-1～10-6个稀释浓度;③第3天，以3mL含0.8g/L G418的DMEM培养液用作G418选择测试;④G418筛选，细胞以含0.8g/L G418的培养液培养7d后，弃去培养液，细胞以100mL/L甲醛固定后用PBS洗涤3遍，培养皿中的细胞以1mL含10g/L美蓝的甲醛染色5min后用自来水冲洗，对未被洗去颜色的细胞以克隆为单位进行计数。病毒滴度即为染色细胞克隆的数目(稀释系数/所加病毒的体积)。
1.3.5 假型逆转录病毒载体转导SMC
①第1天将SMC以3×104个/孔接种于直径为30mm的6孔板中;②第2天SMC生长至约70%～80%融合后，加病毒上清0.5mL(含8mg/L多聚季胺)孵育2h后添加2mL新鲜培养基，培养后行Xgal染色。
2 结果
2.1 SMC鉴定
VSMC行抗α肌动蛋白SABC法免疫组织化学染色鉴定。组织化学染色呈阳性，在细胞胞浆内可见细胞的肌丝被染成棕黄色(图1)。
