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2.2 滴度检测结果
每毫升含重组病毒MuLV颗粒上清液的滴度为5～6.2×105集落形成单位(CFU)，每毫升含重组病毒MuLV/VSVG颗粒上清液的滴度为6～7.8×106CFU。疱疹性口炎病毒G糖蛋白修饰的MuLV/VSVG转染293T/17细胞，比单用MuLV所生产病毒的滴度有明显提高(P<0.05)医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
2.3 假型逆转录病毒载体转导SMC鉴定
转导后SMC行Xgal染色。方法：吸去细胞上清，5g/L Glutaradehyd固定细胞后，PBS清洗3遍后染色。Xgal染液：1g/L XGal (Gibco BRL)，2mmol/L MgCl2，5mmol/L K3Fe(CN)6和5mmol/L K4Fe(CN)6的PBS液，37℃过夜后倒置显微镜下计数10个随机高倍视野下(200×)蓝染细胞与总细胞的比率(图2)。
2.4 基因转导效率的比较
分别将假型逆转录病毒MuLV/VSVG及鼠白血病病毒MuLV转导兔平滑肌细胞，发现MuLV/VSVG的转导效率明显高于MuLV。MuLV/VSVG的转导效率为(92±12)%，MuLV转导效率为(24±5)%，二者差异比较有显著性(P<0.01)。
3 讨论
平滑肌细胞是血管壁的主要细胞成分之一，血管平滑肌细胞增生是血管性疾病如动脉粥样硬化和移植血管再狭窄的重要原因。将相关基因转导到平滑肌细胞中抑制平滑肌细胞增生可以达到治疗血管性疾病的目的。
平滑肌细胞作为基因治疗的靶细胞具有很多独特的优越性如易获取和体外扩增，易受外源基因的转染并能稳定地表达外源基因，致瘤性低和相对其他细胞安全等[8]。
载体的选择直接决定了基因表达的有效性、表达持续时间以及转染的安全性。腺病毒载体作为一种常用的载体转染效率较高，但由于被转染的基因没有融合到染色体，基因的表达是短暂的。而MuLV衍生的逆转录病毒载体可以稳定的转染基因并长期表达。但逆转录病毒载体因转染效率较低[7]，需要通过筛选来杀死未被转染的细胞。为了筛选，需要在基因结构中加入抗性基因和相关的启动子。例如，新霉素类G418，来杀死未转导的细胞。只有转染了目的基因和抗性基因的细胞才能存活下来。如果载体转染基因的效率接近100%，筛选的过程就可以省略。省略筛选既可以简化基因的结构又可以减少筛选的时间和存活细胞复制的时间。提高基因转染效率是逆转录病毒载体用于基因转染的关键。VSVG/MuLV将报告基因lacZ转染到平滑肌细胞的效率达到90%，几乎所有的细胞都被转染，所以可以认为筛选已经不必要了。假型逆转录病毒载体VSVG/MuLV具有高效的基因转导功能[4]，有以下几种因素：①VSVG包膜糖蛋白是单链肽，比MuLV更稳定，稳定的包膜有利于高滴度病毒上清液的产生，提高转导效率。②可以更多地结合病毒的受体，以便VSVG/MuLV与细胞结合。
采用小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞对重组逆转录病毒液进行滴度测定，是由于NIH3T3容易在体外培养，具有较长的寿命，容易被外源基因转导，是良好的基因转移靶细胞。本研究成功的构建了假型逆转录病毒载体VSVG/MuLV，用于转染平滑肌细胞获得了较高的转导效率，说明该载体可以用于平滑肌细胞的基因转染并进一步应用于基因治疗之中医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
【参考文献】
[1]陈勇兵，陈如冲，陈力新. 型假型逆转录病毒载体的构建 [J]. 江苏医药杂志, 2004, 30(9):644646.
[2]YU H, ETON D, WANG Y, et al. High efficiency in vitro gene transfer into vascular tissues using a pseudo typed retroviral vector without pseudo transduction [J]. Gene Ther, 1999, 6(11):18761883.
[3]SONEOKA Y, CANNON PM, RAMSDALE EF, et al. A transient three plasmid expression system for the production of high titer retroviral vector [J]. Nucleic Acids Res, 1995, 23(4):628633.
[4]SCHOLL FG, SEN L, DRINKWATER DC, et al. Effects of human tissue plasminogen gene transfer on allograft coronary atherosclerosis [J]. Heart Lung Transplant, 2001, 20(3):322329.
[5]司徒镇强，吴军正. 细胞培养 [M]. 西安：世界图书出版西安公司， 2004:7177.
[6]DARWIN E, THOMAS TT, WANG Y, et al. Genetic engineering of stent grafts with a highly efficient pseudo typed retroviral vector [J]. Journal of Vascular Surgery, 1999, 29(5):863873.
[7]傅建颖，陈子兴，岑建农. 逆转录病毒介导高效的白血病细胞基因转 [J]. 中华肿瘤志, 2001, 20(3):178183.
[8]曹雪涛，章卫平，陈国友. 肿瘤基因治疗的受体细胞研究进展 [J]. 国外医学肿瘤学分册，2005, 28(2):174175.
