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1 材料与方法
1.1 材料
肝细胞株HL7702由中国科学院上海生命科学研究院细胞库提供;RPMI 1640培养基为美国Gibco公司产品;胎牛血清由杭州四季青生物工程研究所提供;混合气体95% N24% CO21% O2由西安交通大学医学院后勤中心提供;大黄素、Annexinⅴ凋亡试剂盒为美国SIGMA公司产品。AO/EB凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。Fluo3/AM钙离子荧光探针为美国Biotium公司产品;LDH检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。流式细胞仪型号FACSCabuliburTM USA，Olympus荧光显微镜型号BX51TR32FB3E01 Japan。
1.2 冷缺血再灌注损伤模型的建立及实验分组
模拟冷缺血再灌注模型参照文献[6]的方法并加以改进：①肝细胞HL7702体外培养至对数生长期，等量均匀接种于6孔板或25mL培养瓶中，给予大黄素干预，按100、10、1μmol/L分为高、中、低浓度组和对照组(未予大黄素干预)，培养24h准备实验;②模拟缺血：将培养液吸弃，等体积加入模拟缺血溶液(NaCl 98.5mmol/L、KCl 10mmol/L、NaH2PO4 0.9mmol/L、NaHCO3 6.0mmol/L、CaCl2 1.8mmol/L、MgSO4 1.2mmol/L、乳酸钠40mmol/L、HEPES 20mmol/L，pH 6.8，4℃)，并给予大黄素干预。再将培养容器放入缺氧培养装置中，充入混合气体(95% N24% CO21% O2)，待氧分压≤1%时，同时关闭进气口与出气口，放入4℃冰箱保存8h;③模拟再灌注：取出培养容器，吸弃模拟缺血溶液，等体积加入模拟再灌注液(NaCl 129.5mmol/L、KCl 5.0mmol/L、NaH2 PO4 0.9mmol/L、NaHCO3 20mmol/L、CaCl2 1.8mmol/L、MgSO4 1.2mmol/L、葡萄糖55mmol/L、HEPES 20mmol/L，pH 7.4，37℃)，并给予大黄素干预，放入50mL/L CO2孵箱中37℃培养6h。
1.3 细胞内钙离子浓度、细胞凋亡水平及上清液乳酸脱氢酶的检测
Fluo3/AM钙离子荧光探针负载细胞悬液，终浓度10μmol/L，37℃避光孵育30min，PBS洗涤两遍重悬，流式细胞仪检测分析，平均荧光强度代表细胞内钙离子浓度。Annexin VPI双染法检测细胞凋亡率(apoptosis rate)及正常细胞比例(normal cell rate)。AO/EB染色法荧光显微镜下观察细胞凋亡情况，严格按照试剂盒说明书操作，绿色荧光代表正常细胞，橘红色荧光代表凋亡细胞。上清液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)含量的检测严格按照试剂盒说明书操作。
1.4 统计学处理
采用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据用±s表示。统计方法采用单因素方差分析，多重比较用LSDt检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 冷缺血再灌注后细胞内钙离子浓度、细胞凋亡水平及上清液LDH的含量
流式细胞技术检测结果中平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)代表细胞内钙离子浓度，模拟冷缺血再灌注后，各浓度大黄素处理组细胞内钙离子浓度均显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)。并且随大黄素浓度增加，钙离子浓度有降低趋势，各浓度大黄素处理组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。各浓度大黄素处理组细胞凋亡率显著低于对照组，正常细胞比例显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01);低浓度组与中浓度组之间差异不具有统计学意义(P>0.05)，但高浓度组与中、低浓度组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。中、高浓度大黄素处理组培养上清液中LDH水平显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01，表1、图1)。表1 冷缺血再灌注后细胞内钙离子浓度、细胞凋亡水平及上清液中LDH含量的测定(略)
2.2 AO/EB染色在荧光显微镜下的观察结果
AO/EB染色荧光显微镜下观察，高浓度大黄素处理组凋亡细胞较对照组明显减少(图2)医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
3 讨 论
