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1.2 试剂与仪器 去酚红DMEM/F12 细胞培养液(美国Hyclone 公司);DMEM/F12 细胞培养液(美国Hyclone公司);胎牛血清(FBS，美国Invitrogen公司);17β雌二醇(17βestrodiol，E2，美国Sigma公司)和TAM(美国Sigma公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT，美国Sigma公司);96孔板(COSAR公司);PBS液(自行配制);RNA酶(市售);碘化丙啶(PI，市售);流式细胞仪(美国Bectondickinson公司)。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养：用含5%FBS的DMEM/F12培养液，在37℃、95%空气、5%二氧化碳的条件下进行培养，传代三代以上。
1.3.2 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定子宫内膜癌细胞HEC1B细胞生长情况：细胞消化后以2×104/ml浓度接种入96孔板，每孔150 μl。隔日换液。用含1%活性炭处理的胎牛血清的去酚红DMEM/F12培养液继续培养24 h，将细胞分组处理：E2(10-8M)组、TAM (10-7M )组、对照组，分别刺激24、48、72、96 h。每组8个复孔。3组按相应时间用MTT法测定细胞生长情况，选择492 nm波长测定吸光值。
1.3.3 流式细胞术(FCM)测定细胞周期：细胞换用无酚红DMEM/F12培养液培养24 h后分别加入E2(10-8M)、TAM (10-7M)及培养液刺激24、48、72、96 h。3组细胞用胰酶/EDTA消化后，制成活的单细胞悬液，室温1 000 r/min离心5 min，吸去上清。加入0.01 mmol/L PBS洗两遍，镜下计数每组细胞总数均在(2～5)×106个。离心去除PBS，加入预冷的70%的乙醇固定，4℃过夜。14 000 g短时离心沉淀细胞，弃去固定液， PBS洗1次。离心去除PBS，加入RNA酶(100 μg/ml)，室温30 min酶切RNA。PI溶液(终浓度为100 μg/ml)1 ml搅拌，4℃避光20～30 min。流式细胞仪检测：以激发波长488 nm测定。采用S 期细胞比率(SPF)作为分析指标：SPF(%)=[S/(G0G1+S+G2M)]×100%。
1.4 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以±s表示，组间差异采用One Way ANOVA进行处理，FCM结果采用描述性分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MTT法测定药物刺激不同时限HEC1B细胞生长情况
2.1.1 E2作用HE1B细胞不同时间吸光值比较：加入E2后24 h和48 h，E2组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)，加药后72 h和96 h，E2显著刺激HEC1B细胞生长(P<0.05)。见表1。表1 E2作用不同时间的吸光值比较
2.1.2 TAM作用HEC1B细胞不同时间吸光值比较：加入TAM后24 h和48 h，TAM组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)，加药后72 h和96 h，明显刺激HEC1B细胞生长，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。表2 TAM作用不同时间吸光值比较
2.2 应用流式细胞仪分析不同药物对细胞周期的影响 HEC1B细胞加入E2刺激后，S期细胞比率在加药72 h和96 h逐渐高于对照组，细胞增殖活跃。TAM作用细胞后，SPF值在24 h无明显增高，48 h开始有升高趋势，SPF在加药72 h和96 h均明显高于对照组。见表3。表3 3组药物刺激不同时间SPF值比较
3 讨论
3.1 雌激素对子宫内膜癌细胞的影响 70%～80%子宫内膜癌为激素依赖型肿瘤，其发生与子宫内膜长期接受雌激素的频繁刺激而缺乏孕酮拮抗有关。多数子宫内膜癌患者具有高雌激素状态，证实了肿瘤对体内高雌激素的依赖性[2]。本实验结果显示，雌激素可明显促进子宫内膜癌HEC1B细胞的生长，能使S期细胞比例明显升高，促进细胞的分裂、增殖，减少细胞凋亡。子宫局部血流内高雌激素血症是引起子宫内膜增生的关键因素，认为高浓度的E2水平对二倍体内膜癌细胞的生长有促进作用。国外学者对子宫内膜腺癌细胞系HEC1A、ECC1和PRAB36进行研究，发现17β雌二醇具有促进子宫内膜癌细胞生长作用，其作用与不同的雌激素受体亚型有关[3,4]。雌激素的作用途径[5]主要是通过与细胞内特异性受体ERα、ERβ在细胞核内结合，激活转录，使细胞核内DNA和蛋白质合成增加，导致子宫内膜上皮细胞增生。或是通过细胞膜的非基因转录，发生快速效应，其具体机制尚不明确。张丽丽等[6]研究认为，17β雌二醇可以通过细胞膜受体对子宫内膜癌Ishikawa细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的快速激活效应，引起细胞生物学变化医.学.全.在.线www.lindalemus.com。
