 |
 |
1 材料与仪器
SP650S强阳离子交换层析柱料、CM650S弱阳离子交换层析柱料(日本TOSOH公司生产); Amicon TM Stirred Cell超滤装置、再生纤维素超滤膜(截留分子量1000)(美国Millipore公司);Biologic LP层析系统(美国BioRad公司);BETA18K型冷冻干燥机(德国CHRIST公司);Delta320pH计(梅特勒托利多公司)。
2 实验方法
将rhk2a按照最佳工艺条件修饰后得到的mPEGrhk2a 修饰反应混合物， 用截流分子量为 1 000的超滤膜超滤除盐，然后用被缓冲溶液平衡后的阳离子层析柱进行分离纯化[3,4]，考察不同盐离子浓度缓冲液的分离效果，收集各洗脱峰的流出液，将收集液超滤除盐后， 转入50 mL离心管中， 于-80 ℃下预冻3～4 h，在-35～-20 ℃下抽真空冷冻干燥24 h，所得产物用TrisTricine系统进行SDSPAGE电泳检测。
2.1 平衡、洗脱缓冲液pH值的选择
2.1.1 SP650S强阳离子交换层析柱平衡、洗脱缓冲液pH值的选择 取试管7支，各加 1 g SP650S强阳离子交换层析柱料后，分别用纯水洗涤，每次10 mL，洗5次。考虑到mPEGrhk2a的稳定性[5,6]，各加入pH值分别为4.0、4.6、5.0、5.4的醋酸钠醋酸缓冲液与pH值分别为6.0、6.5、7.0的磷酸钠磷酸缓冲液淋洗，每次10 mL，洗5次，待柱料平衡稳定，在每管中加入2 mg 的mPEGrhk2a，摇动试管5～15 min，静置待柱料下沉，取每管上清液于280 nm下测定其紫外吸收值。
2.1.2 CM650S弱阳离子交换层析柱平衡、洗脱缓冲液pH值的选择 取试管7支，各加 1 g CM650S弱阳离子交换层析柱料后，余下操作同“2.1.1”医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
2.2 2种离子交换层析柱分离纯化修饰产物的条件
SP650S强阳离子交换层析柱的规格为2.6 cm×4 cm(柱容量1 CV=25 mL)，柱平衡液为3 CV的pH4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液，流速为1 mL/min，检测波长为280 nm，色谱柱清洗液为5 CV 的0.5 mol/L NaOH溶液。CM650S弱阳离子交换层析法的色谱条件同上。
SP650S强阳离子交换层析法用于梯度洗脱的缓冲液见表1;CM650S弱阳离子交换层析法依次更换的洗脱液为NaCl含量分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 mol/L 的pH 4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液各5 CV。
3 结 果
3.1 SP650S强阳离子交换层析和CM650S弱阳离子交换层析洗脱条件的选择与比较表1 SP650S强阳离子交换层析法所用的梯度洗脱液醋酸盐缓冲液的比例第一组100%→0%0%→100%(20 CV)第二组前半段100%→40%0%→60%(20 CV)后半段40%→0%60%→100%(10 CV)第三组100%→50%0%→50%(20 CV)
用一系列不同pH值的缓冲液平衡2种离子交换层析柱料，测得其相应上清液的紫外吸收值，结果如表2所示，随着缓冲溶液pH值的升高，上清液的紫外(UV)吸收值增加，即洗脱液中的蛋白质含量增加;缓冲液的pH值越低，离子交换柱料与mPEGrhk2a的结合量越大,在同一pH值下，SP650S强阳离子交换柱料的mPEGrhk2a结合情况优于 CM650S弱阳离子交换柱料。因此，选用pH4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲液平衡、洗脱2种层析柱，此时色谱柱有效交换容量最大，mPEGrhk2a的分离效果相对较好。表2 不同pH值缓冲液下SP650S与CM650S柱料上清液的紫外吸收值
3.2 SP650S强阳离子交换层析法分离修饰产物
