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用pH4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲溶液平衡SP650S强阳离子交换柱后上样,mPEGrhk2a修饰反应所得混合产物依次采用盐离子浓度梯度逐渐变缓的3组缓冲液进行洗脱，分离结果分别如图1的A、B、C所示洗脱液中溶液电导率在5～7 ms/cm时，mPEGrhk2a能被洗脱下来，盐离子浓度梯度变化越缓，mPEGrhk2a修饰产物各洗脱峰的分离度越高，则可将色谱图3所对应的洗脱条件作为强阳离子交换层析法的最佳分离条件。
收集在最佳分离条件(第3组缓冲液洗脱)下的吸收峰①、②、③、④所对应的流出液，超滤除盐、冻干，将分离产物进行SDSPAGE电泳检测，结果如图2所示：mPEG修饰产物与未修饰的rhk2a得到很好的分离，由各电泳条带的分子量初步判断，单修饰产物mPEGrhk2a在峰③中出现。
3.3 CM650S弱阳离子交换层析法分离修饰产物
用pH 4.0的0.02 mol/L醋酸盐缓冲溶液平衡CM650S弱阳离子交换柱后上样，mPEGrhk2a修饰反应所得混合产物，依次更换含NaCl盐离子浓度不同的缓冲液进行梯度洗脱,结果如图3所示,主要修饰产物被穿流洗出。收集图3中吸收峰①、②、③所对应的流出液，超滤除盐、冻干，将分离产物进行SDSPAGE电泳检测，结果如图4所示：mPEGrhk2a修饰产物主要在穿透峰中出现，未修饰的rhk2a在0.1
4 讨 论
由于mPEGrhk2a偶联蛋白异构体除了分子量和表面电荷的细小差别之外，其他的理化性质非常接近，因此偶联产物的分离纯化一直是蛋白质PEG化技术的难点之一。蛋白质与PEG偶联之后表面电荷会发生变化，利用这种电荷差异可以将偶联蛋白分离，故国内外多采用离子交换层析法分离PEG修饰混合物[7]。
rhk2a中N末端氨基与mPEG共价结合后，失去与氢质子的结合能力，蛋白质分子中的正电荷会减少，因此mPEGrhk2a的等电点比rhk2a低。另一方面，由于mPEG长链会阻碍rhk2a与离子交换剂之间的电荷相互作用，即产生立体屏蔽作用，导致mPEGrhk2a在离子交换层析中的流出行为与rhk2a有所不同。这两方面因素决定采用离子交换层析法能够分离纯化mPEGrhk2a修饰反应混合物[7]。
由于阴离子交换树脂结合的主要是蛋白质的羧基，受氨基修饰影响较小，因而选择阳离子交换树脂分离纯化mPEGrhk2a。本文实验结果也证明，用强阳离子交换层析法分离mPEGrhk2a修饰反应混合物时，修饰产物mPEGrhk2a在柱上的保留时间比未修饰的rhk2a要短。说明mPEG修饰确实降低了rhk2a的等电点，屏蔽了rhk2a与离子交换剂之间的静电作用，使得在相同pH值条件下，修饰产物在柱上的吸附能力较弱。
用弱阳离子交换层析法分离mPEGrhk2a时，mPEGrhk2a修饰产物主要在穿透峰中出现，是因为mPEG修饰显著地降低了mPEGrhk2a的等电点，导致弱阳离子交换层析柱对mPEGrhk2a的结合力太弱，无法获得理想的分离效果。
本研究证明，修饰产物mPEGrhk2a,在平衡液的pH值为4.0时，与SP650S强阳离子交换层析柱有良好的结合;在洗脱液中溶液电导率在5～7 ms/cm时，可被洗脱下来，并且与未修饰的rhk2a分离度良好，因此获得了纯度较高的mPEGrhk2a，为下一步的深入研究奠定了基础医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
