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2.3.1 对照组SP-C和AQP5 mRNA的表达情况
对照组于第1、5、8天检测AQP5和SP-C mRNA的表达情况。在共培养开始第1天，可检测到AQP5的mRNA表达，但AQP5的表达比较弱，不同时间段差异不明显，而在不同时间段SP-C都没有表达(图5)。
2.3.2 实验组A SP-C和AQP5 mRNA的表达情况
实验组A所检测到的SP-C和AQP5 mRNA的表达情况与对照组观察结果相似(图6)。
2.3.3 实验组B不同时间段SP-C和AQP5 mRNA的表达情况
实验组B在共培养的各时间段可同时检测到AQP5和SP-C mRNA的表达(图7，图8)。
2.3.4 不同实验处理组中AQP5和SP-C mRNA的表达量的比较
对照组和实验组A各时间点均未见SP-C mRNA的表达，而在实验组B于共培养的第1、5、8天的SP-C mRNA的表达量分别为1599.00±158.95、2066.80±101.30、3893.00±178.60。不同处理组的AQP5 mRNA的表达量见表1。实验组B各时间点AQP5 mRNA的表达量与对照组比较，AQP5 mRNA的表达量明显增多(F=78.61，P<0.01)，而与实验组A的AQP5 mRNA的表达量比较，也有统计学差异(F=67.38，P<0.01)。但是，实验组A各时间点则与对照组比较无明显统计学差异(F=1.45，P>0.05)。表1 不同处理组AQP5mRNA的表达量的比较(略)
3 讨 论
AECⅡ具有分泌肺泡表面活性物质、调节肺泡表面张力、维持肺液体平衡和多种防御功能，不仅可以修复肺泡的正常结构，更可以有效地恢复功能，从而阻止和修复肺损伤[5]。因此，体外或者体内诱导干细胞分化为AECⅡ一直是肺损伤修复的一个研究热点。研究表明，SP-C是AECII细胞表达的特征性蛋白，AECⅡ细胞可能是AECI的祖细胞，当AECⅡ可以转化为AECI后，获得AECI的表型特征AQP5，同时失去AECⅡ的表型标志SP-C[6]。因此，本实验选用SP-C和AQP5两个特异性蛋白来鉴定干细胞诱导分化为肺泡上皮细胞的效果。
本实验建立的悬挂式体外非接触共培养小室，当MSCs单独静置培养时，或者与正常肺组织单细胞悬液共同培养时，在共培养的全部时段，都未检测到AECⅡ表达的特征性蛋白SP-C的表达，说明干细胞都没有转换为AECⅡ或者转化为AECⅡ细胞的数量非常少。该两种情况下都有AQP5的表达。而且，AQP5的表达量也没有变化。KOTTON[7]及其同事的研究发现体外培养的MSCs可表达AECI的特异性标记物AQP5，这种细胞亚型可能是肌细胞、骨细胞和脂肪细胞的多潜能干细胞。推测所检测到的AQP5表达是MSCs自身表达的结果，MSCs没有向AECI分化。而损伤肺组织与MSCs共培养时，不但有SP-C的表达，而且随着时间的延长，表达量逐渐增加，说明MSCs成功转换为AECⅡ;同时，AQP5表达量明显高于实验组A和对照组。我们推断AQP5表达量增加部分是由AECⅡ细胞转化为AECI细胞引起的或是MSCs直接分化为AECI。这与文献报道的用博来霉素导致小鼠肺损伤时，静脉注射外源性的MSCs，在受体小鼠肺中，比骨髓间充质干细胞移植前，MSCs总的DNA的含量升高23倍，同时AECⅡ的含量升高3倍的研究结果一致[8]医学全.在线www.lindalemus.com。
骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在不同的环境、不同的培养液中可以分化为多种细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、肝细胞、神经元样细胞、表皮细胞、血管内皮细胞等[9]。一种理论认为组织及器官损伤可以被干细胞感知，迁移到损伤部位并分化为器官特异的细胞，以修复损伤器官的结构和功能[10]。本研究通过非接触共培养，采用聚碳酸脂膜将损伤肺组织与干细胞分开，使损伤肺组织细胞不能通过，而细胞分泌的细胞因子可以自由通过，成功建立了体外非接触共培养诱导骨髓间充质干细胞分化为肺泡上皮细胞的模型，验证了该理论的正确性。研究报道，之所以损伤细胞能够诱导MSCs分化为损伤特异性的细胞，可能是因为损伤细胞分泌的特殊的细胞因子刺激MSCs或者是损伤细胞激活某个信号传导[2]。本研究中MSCs分化为肺泡上皮细胞的具体机制需要进一步的研究。
采用骨髓间充质干细胞在细胞替代治疗、基因治疗以及组织器官的再造中具有重要的临床应用价值。骨髓采集方便、安全、损伤小，供者无明显并发症，有利于体外扩增和自体回植。本研究成功建立了体外诱导MSCs分化为肺泡上皮细胞的模型，有望为临床建立永不枯竭的肺细胞和组织来源，以修复和取代受损伤的肺组织和细胞，为根本性治疗肺损伤提供实验基础。
【参考文献】
1]WANG W, QIAN LL, SUN S, et al. Engraftment of bone marrow stromal cells in lipopolysaccharide-injured mouse lungs [J]. Zhongguo Dangdai Er Ke Zazhi, 2009, 11(5):321-327.
[2]ROJAS M, XU J, WOODS CR, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung [J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2005, 33(2):145-152.
[3]POPOV BV, SERIKOV VB, PETROV NS, et al. Lung epithelial cells induce endodermal differentiation in mouse mesenchymal bone marrow stem cells by paracrine mechanism [J]. Tissue Eng, 2007, 13(10):2441-2450.
[4]朱翠平，杜江，封志纯. 角化细胞生长因子在地塞米松干预高氧新生鼠肺组织的表达 [J]. 中华围产医学杂志, 2006, 9(3):181-184.
[5]陈慧，王振花，张建平，等. 胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、原代培养与鉴定 [J]. 中山大学学报：医学科学版, 2006, 27(5):496-499, 505.
[6]XU W, FU JH, XUE XD. Expression of HoxB5, SPC and AQP5 in neonatal rats with hyperoxia-induced chronic lung disease [J]. Zhongguo Dangdai Er Ke Zazhi, 2009, 11(1):51-55.
[7]KOTTON DN, FABIAN AJ, MULLIGAN RC. Failure of bone marrow to reconstitute lung epithelium [J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2005, 33(4):328-334医学全.在线www.lindalemus.com.
[8]ORTIZ LA, GAMBELLI F, MCBRIDE C, et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(14):8407-8411.
[9]姚天华，李晓红，熊曦州，等. 大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及体外诱导实验 [J]. 西安交通大学学报：医学版, 2006, 27(3):233-235,257.
[10]LEVESQUE JP, WINKLER IG. Obilization of hematopoietic stem cells: state of the art [J]. Curr Opin Organ Transplant, 2008, 13(1):53-58.
