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脂联素(adiponectin, APN, Acrp30)是由脂肪细胞分泌的一种蛋白质。研究证实脂联素与胰岛素抵抗密切相关，具有抗动脉粥样硬化形成、抗炎症和损伤后抗内膜增生的特性。因此，脂联素与糖尿病心血管疾病密切相关，脂联素水平的下降是糖尿病及其心血管并发症的一个重要的独立危险因素[34]，补充脂联素可能是对上述疾病的一种新的治疗手段。转基因技术是补充脂联素的一种方法。在本课题前期研究中，我们课题组已成功构建rAAV2/1Acrp30载体[4]和糖尿病动脉粥样硬化模型[5]。在本次研究中，我们将探讨rAAV2/1Acrp30对2型糖尿病动脉硬化模型大鼠黏附分子及NFκB的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物 6月龄雄性SPF级自发性糖尿病GK大鼠90只[购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，质量合格号：SCXK(沪)20060003]。适应性饲养1周后，选取随机血糖值(罗氏全血葡萄糖测试仪)在11.1mmol/L以上的GK大鼠88只纳入本实验。按1只/笼饲养于独立通气笼具(IVC)系统内。温度(22±1)℃，湿度59%～61%，每天光照与黑暗时间各12h。所用笼具、饲料、垫料、饮水均高压灭菌(15磅，20min)。实验期间的灌胃、换水、添加饲料等操作均在超净工作台内进行，由专人管理。
1.2 试剂和仪器 Rneasy Mini Kit：QIAGEN;ReverTra AceαTM，First Strand cDNA Synthesis Kit：TOYOBO;Taq DNA聚合酶：美国Fermentas公司;dNTPs：美国Fermentas公司，DNA Marker DL 2000：TaKaRa;大鼠ICAM1 ELISA试剂盒：美国ADL公司;琼脂糖：西班牙进口分装;rAAV2/1Acrp30：本课题组合成;空载腺相关病毒：本元正阳生物公司;H7500透射电子显微镜：日本日立电子公司;AL104电子天平：MettlerToledo公司;超净台：BOXUN公司;PCR仪：Biometra;UNOⅡ水平电泳槽：北京君意东方仪器公司，JYSPC;电泳仪：北京鼎国生物技术发展中心，DGⅢ双稳数显电泳仪;凝胶成像系统：柯达紫外显相系统400W像素;酶标分光仪：Quant Instuments inc公司。
1.3 动物建模 大鼠适应性饲养1周后，随机选取血糖值(怡成全血葡萄糖测试仪)在11.1mmol/L以上的GK大鼠，同时喂饲高脂饲料(普通饲料87.5%、精炼猪油10%、胆固醇2.0%、猪胆盐0.3%，丙基硫氧嘧啶0.2%)。模型组在喂饲高脂饲料的基础上加用10mg/(kg·d)一氧化氮合成酶(nitric oxide svnthase, NOS)抑制剂—N硝基L精氨酸甲酯(LNAME)灌胃。同时，Wistar组喂饲普通饲料，生理盐水灌胃，连续8周[5]。
1.4 实验动物分组及处理 除去造模失败及死亡大鼠，将30只动脉硬化GK鼠纳入本实验。随机数字法分为以下三个处理组：①模型1组(model group one, M1)：后肢肌肉注射生理盐水;②模型2组(model group two, M2)：后肢肌肉注射空病毒rAAV2/1;③治疗组(treatment group, T)：后肢肌肉注射rAAV2/1Acrp30：1×1012mg/L。
1.5 标本采集 光镜和扫描电镜样本制备及观察。
治疗阶段：实验第0，8周，各组大鼠在禁食的基础上，眶静脉采血一次约2mL，低速离心机3300r/min离心后分离出血清。实验第8周，在禁食的基础上处死所有大鼠，用100mL/L的水合氯醛按3mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。迅速打开胸腔，腹主动脉采血。低速离心机3300r/min离心后分离出血清，用于测定血脂及sICAM1。将灌流针从心尖部位插入左心室至主动脉，快速灌注100mL生理盐水，再用500mL生理盐水经心脏反复灌洗至发白，灌毕约30min，取主动脉弓下段2～3cm主动脉，用预冷的生理盐水清洗，去除周围结缔组织，于-70℃冰箱保存。
1.6 指标测定 ELISA法测血清sICAM1，sVCAM1。试剂盒购自美国ADL公司。RTPCR测主动脉NFκBp65 mRNA。
1.7 统计学方法 各实验独立重复3次以上，重复性好。利用SPSS11.0软件进行统计分析。计量数值皆以±s表示。多样本均数间采用单因数方差分析(oneway ANOVA)，方差不齐的采用TamhanecsT2统计方法检验，P<0.05表示差异有显著性意义。
2 结 果
rAAV2/1Acrp30对模型大鼠血清sICAM1、sVCAM1、主动脉NFκBp65 mRNA水平的影响显示：治疗8周后，T组sICAM1，sVCAM1水平较M1组及M2组明显下降(P<0.05，见表1、表2)，T组治疗前(0周)与治疗后(8周)相比，sICAM1、sVCAM1水平明显下降(P<0.05，表1、表2)。治疗组T主动脉处NFκBp65 mRNA表达水平较M1组及M2组低(P<0.05，表3、图1)。表1 各组大鼠血清可溶性细胞间黏附分子变化表2 各组大鼠血清可溶性血管细胞间黏附分子的变化表3 各组大鼠主动脉NFκBp65 mRNA表达水平的半定量比较
3 讨 论
脂联素是由脂肪细胞分泌的一种蛋白质。研究证实脂联素与胰岛素抵抗密切相关，具有抗动脉粥样硬化形成、抗炎症和损伤后抗内膜增生的特性。已有大量研究把脂联素作为抗动脉粥样硬化及抗炎的治疗手段，将表达人脂联素的腺病毒转染给载脂蛋白E缺乏小鼠，14d后动脉窦处的动脉粥样斑块与对照组比较减小约30%，免疫组织化学显示腺病毒携带的脂联素转移入粥样硬化斑块脂纹的泡沫细胞内[67]。
A, M: marker; 1: system materials for internal reference (GAPDH); 2: model group one (M1); 3: model group two (M2); 4: treatment group (T)脂联素基因敲除的大鼠出现血管炎症反应，导致血管机械性损伤，新生血管壁增厚，血管平滑肌增生。此时如果补充脂联素，那么这些情况就会改善[6]。脂联素可以抑制血管内皮细胞炎症及黏附，抑制泡沫细胞的形成，抑制血管平滑肌的增殖，抑制炎性因子的产生等，在动脉粥样硬化形成的各个阶段发挥其保护作用医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
