 |
 |
1.4 心肌细胞蛋白质含量的测定(改良Lowry法) 6孔培养板培养的心肌细胞，加入1 mg/ml牛血清白蛋白，用双蒸水定容至2.98 ml。按操作步骤处理后，用紫外分光光度计660 nm比色，对照标准曲线，测定细胞总蛋白质含量。
1.5 心肌细胞大小的测定 心肌细胞加药持续5天后，用胰酶消化使之脱落，在相差显微镜下拍照。每孔取10个视野，每个视野取10个细胞，采用HJ2000通用图像分析系统，通过标尺测量细胞表面积，取平均值。
1.6 CCK-8法检测心肌细胞活性 96孔培养板培养的心肌细胞，每孔加入10 μl CCK-8(5 g/L)溶液，37 ℃孵育1~2 h，采用全自动酶标仪于450 nm波长测OD值(A)，OD值的大小反映活细胞的数量。
1.7 Western Blot检测 取心肌细胞的蛋白提取液进行10%SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色、脱色至背景清晰。电泳结束后，进行电转移，转移后的PVDF膜切取标准蛋白泳道进行膜染色。其余用洗膜缓冲液洗5 min，用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭，洗膜，浸入一抗(1∶200)，4 ℃过夜。液膜浸入二抗(1∶1 000)，定温孵育2 h。洗膜，ECL试剂显色。用四星图像分析系统测定Western Blot蛋白条带的灰度值，计算目的条带和内参条带的比值。分别以α1C、α1G、α1H带与β-actin带灰度比表示α1C、α1G、α1H蛋白相对含量。
1.8 钙成像试验 将培养的心肌细胞吸去培养液，用终浓度5 μmol/L的Fluo-3/AM溶液染色，进行Fluo-3/AM负载，采用激光共聚焦显微镜进行钙离子浓度基线扫描。通过共聚焦显微扫描分析胞内游离Ca2+浓度动态的变化。
1.9 统计学方法 采用Origin7.5软件进行统计学分析，各组计量资料以x±s表示，组间比较采用进行方差分析，两两比较采用t检验，P<0.05示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 不同浓度SIM对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的影响 见表1。AngⅡ+SIM(10-8～10-7 mol/L)组心肌细胞总蛋白含量较AngⅡ组均无明显变化(P>0.05)。表明10-6～10-4 mol/L终浓度的SIM均能有效抑制AngⅡ诱导的心肌细胞蛋白合成增加，其中10-6 mol/L SIM为抑制AngⅡ诱导心肌细胞蛋白合成增加的最适有效浓度。
2.2 SIM、Ver对AngⅡ诱导心肌细胞肥大的影响
见表2。AngⅡ+SIM+MVA组蛋白含量及细胞表面积与AngⅡ组比较则无明显变化(P>0.05)。表明SIM能有效抑制心肌细胞蛋白合成的增加及细胞表面积的增加，且与Ver作用相似，两者差异无统计学意义。MVA则拮抗了SIM对心肌细胞蛋白合成以及细胞表面积的增加的抑制作用医学 全在.线提供www.lindalemus.com。
2.3 SIM对心肌细胞活力的影响 AngⅡ组A450nm值与对照组比较明显下降(P<0.01);同时分别给予10-8～10-4 mol/L SIM或者Ver干预，结果表明给予10-6～10-4 mol/L SIM或Ver处理后，A450nm值显著高于AngⅡ组(P<0.01)，但给予10-8～10-7mol/L SIM后，A450nm值与AngⅡ组比较差异无统计学意义(P>0.05);AngⅡ+SIM+MVA组与AngⅡ组比较亦差异无统计学意义(P>0.05)。提示AngⅡ可诱导细胞活力显著下降，应用10-6～10-4 mol/L SIM和Ver均可显著提高心肌细胞活力，其中10-6 mol/L SIM的作用效果最佳(P<0.01)，而MVA则抑制了SIM对心肌细胞活力增强的作用(图1)。
2.4 SIM对AngⅡ诱导心肌细胞钙通道蛋白表达的影响 各实验组L-型钙通道亚单位α1C蛋白表达量与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。AngⅡ组与对照组相比，α1G、α1H蛋白表达均明显增加(P<0.01);AngⅡ+SIM组、AngⅡ+Ver组α1G、α1H蛋白表达较AngⅡ组均显著下降(P<0.01);AngⅡ+SIM组和AngⅡ+Ver组相比差异无统计学意义(P>0.05);而AngⅡ+SIM+MVA组与AngⅡ组比较，α1G、α1H蛋白表达无明显差异(P>0.05)(图2，3)。结果表明，AngⅡ诱导的肥大心肌细胞T-型钙通道亚单位α1G、α1H蛋白表达均明显增加。SIM或Ver对心肌细胞肥大引起的T-型钙通道α1G、α1H蛋白表达增加均具有明显的抑制作用，且二者作用效果相似，而MVA则拮抗了SIM对α1G、α1H蛋白表达的抑制作用。SIM或Ver对L-型钙通道亚单位α1C蛋白表达则无明显影响。
2.5 SIM对AngⅡ诱导心肌细胞钙离子超载的影响 AngⅡ组心肌细胞内钙离子浓度明显升高;当同时加入SIM时，则明显抑制了AngⅡ引起的细胞内钙离子浓度的升高, 且这种抑制作用具有浓度依赖关系，其中SIM 10-6 mol/L时作用最显著(P<0.01);而AngⅡ+SIM+MVA组心肌细胞内钙离子浓度与AngⅡ组比较差异无统计学意义(P>0.05);Ver阳性对照组与AngⅡ组比较钙离子浓度明显降低(P<0.01)(图4，见封二)。结果表明，10-6～10-4 mol/L SIM均能明显抑制AngⅡ引起的心肌细胞钙超载，其作用与Ver相似，提示SIM可能与Ver一样，均通过阻断钙通道降低心肌细胞钙超载而发挥作用，而MVA则拮抗了SIM对心肌细胞钙超载的抑制作用。
3 讨 论
业已证明，AngⅡ具有生长因子样作用，是刺激心肌肥大的主要生物活性物质之一。本实验结果显示，在原代培养的新生大鼠心肌细胞中加入AngⅡ作用一定时间后，心肌细胞蛋白合成及心肌细胞表面积均明显增加，这一结果与本课题组以往的研究及其它文献报道的结果是一致的[2]，表明本研究采用AngⅡ诱导心肌细胞肥大的实验模型已成功建立。
