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[14] Ting Wang,Wenxiu Li,Yingjie Deng,et al.Preparation of submicron unilamellar liposomes by freezedrying double emulsions[J].Biochim Biophys Acta,2006,1758:222231.【摘要】 目的 探讨存活素siRNA表达质粒(mU6/survivin质粒)对化疗药物抑癌作用的影响。方法 采用MTT法检测mU6/survivin质粒与多种常规肿瘤化疗药物对乳腺癌MCF7细胞增殖的联合作用。结果 比较单纯化疗药物作用组的各相应浓度点，siRNA表达质粒mU6/survivin与化疗药物顺铂、环磷酰胺、5氟尿嘧啶或秋水仙碱合用组对肿瘤细胞MCF7的细胞增殖抑制率均明显提高，差异均有统计学意义(P<0.01);对靶向DNA药物如顺铂、环磷酰胺和5氟尿嘧啶的抗癌性能具有显著的协同增强作用(二者合用效应Q值均>1)，但对靶向微管的药物秋水仙碱没有相加作用(Q值<1)。结论 在解除肿瘤细胞中存活素功能的基础上进行药物化疗，可能是肿瘤治疗的一个新的可行方向。
【关键词】 存活素;siRNA;质粒;化疗药物
Effect of survivin siRNA expression plasmid on antitumor role of chemotherapeutic drugsLI Liping1, LUO Chaoquan2, ZHANG Zhizhen1, LIANG Nianci1 (1. Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China)Abstract: Objective To study the influence of survivin siRNA expression plasmid on antitumor role of chemotherapeutic drugs. Methods The combined role of mU6/survivin plasmid and several chemotherapeutic drugs in the proliferation of MCF7 cells was determined by MTT method. Results The combined use of mU6/survivin plasmid and cisplatin, cyclophosphamide, 5fluorouracil or colchicine resulted in significant inhibition of MCF7 cells compared with the single use of mU6/survivin plasmid or chemotherapeutic drugs (P<0.01). The synergistic effect was observed in the combination of pmU6/survivin and cisplatin, cyclophosphamide and 5fluorouracil (Q>1) other than colchicine (Q<1). Conclusion The combination of chemotherapy and survivin deprival may be a novel regimen for cancer patients.
Key words: surviving; siRNA; plasmid; chemotherapeutic drug
肿瘤手术切除结合化学药物的细胞毒性治疗仍然是当今肿瘤治疗的主要手段，顺铂、环磷酰胺、5氟尿嘧啶(5Fu)和秋水仙碱都是广泛应用于临床实践的常规肿瘤化疗药物，但其药效并不总是理想，肿瘤治疗后伴随而来的耐药或多药耐药性(MDR)更是治疗过程中难以克服的障碍。存活素特异性地表达于肿瘤细胞中，临床数据显示，存活素表达高低与肿瘤患者的存活率相关[1]。我们针对存活素基因设计和克隆的mU6/ Survivin siRNA表达质粒[2]，能高效地剔降乳腺癌MCF7细胞中的存活素mRNA以及蛋白质的表达。本实验运用该质粒剔降乳腺癌细胞MCF7中存活素的表达，之后施以化学毒性药物进行治疗，观察顺铂、环磷酰胺、5Fu和秋水仙碱在存活素被沉默之后的抗癌效果。
1 材料和方法
1.1 试剂
空载体mU6pro由美国Michigan大学Dave Turner博士惠赠; ProFection 哺乳类转染系统购自Promega公司; 5Fu(≥99%)、环磷酰胺(≥99%)、秋水仙碱(99.6%)购自南京学子医化研发中心;顺铂注射液(1 mg/mL)由江苏豪森药业股份有限公司生产;乳腺癌细胞MCF7为本科室保存。
1.2 细胞培养和转染
MCF7细胞生长于含15 %小牛血清、0.5 U/mL胰岛素、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI1640完全培养基中，置37℃，5% CO2饱和湿度孵箱内孵育。细胞转染采用磷酸钙法，操作按ProFection哺乳类转染系统(Promega)试剂盒说明书进行。pEGFPN1和mU6/survivin质粒以1∶3的比例共转染MCF7细胞，在60 mm培养皿上转染3 μg mU6/survivin质粒, 荧光显微镜检测细胞表达绿色荧光蛋白EGFP的效率来确定转染效率均超过80%，空载体mU6pro转染细胞作为空白对照。
1.3 肿瘤化疗药物增敏性实验
将细胞接种到60 mm培养皿中，转染mU6/survivin质粒或mU6pro空载体12 h后，0.25%胰酶消化，按0.5×104/孔接种于96孔板，在37℃、5% CO2下培养24 h，分别加入DMSO或终浓度为10、20、40、80和160 g/L的顺铂、环磷酰胺、5Fu、秋水仙碱，继续培养24 h, MTT法检测细胞增殖情况。每孔加入10 μL 5 g/L MTT ，继续温育4 h，然后加入100 μL DMSO，裂解细胞15 min，酶标仪读取光密度值OD570nm/450nm。按下列公式计算细胞增殖抑制率：B=对照组OD值，A=实验组OD值，抑制率=(1A/B)×100%。合用效应用Q值来表示[3]，Q值=实测合并效应/期望合并效应=实测抑制率/(EA+EBEA×EB)，EA、EB分别代表质粒、化疗药物单独作用时的抑制率。Q值<1为拮抗，Q值=1为相加，Q值>1为增强。单纯药物作用组转染空载体mU6pro+药物，单纯质粒作用组转染mU6/survivin质粒+DMSO，药物质粒合用组转染mU6/survivin质粒+药物。
1.4 DNA琼脂糖电泳检测DNA裂解实验
转染mU6/survivin质粒36 h后，加入浓度为20 g/L的不同的肿瘤化疗药物,如顺铂、环磷酰胺、5Fu或秋水仙碱等，继续培养24 h。收集细胞，PBS洗3次，加50 μL细胞裂解液(1 % NP40,20 mmol/L EDTA, 50 mmol/L TrisHCl pH 7.5)处理10 s，1500 g离心5 min，获得上清，重复裂解1次，合并上清。加10 μL 10 % SDS，2 μL 10 g/LRNase A,37℃水浴2 h, 加4 μL 20 g/L蛋白酶K,56 ℃水浴2 h,随后加70 μL 10 mmol/L NH4Ac,600 μL无水乙醇沉淀DNA，4 ℃条件下15000 g离心15 min，1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，照相。
1.5 统计学处理
计量数据用(±s)%表示，Student's test确定组间统计学意义，以P<0.05为差异有统计学意义。
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2.1 mU6/Survivin质粒增强顺铂对MCF7细胞的细胞毒性
结果见表1。顺铂单药能有效地抑制MCF7细胞的生长，并随着顺铂浓度升高，其细胞增殖抑制率逐渐升高。当它与mU6/Survivin质粒合用时，比较顺铂单药组各对应浓度点，其细胞增殖抑制率明显增大，差异均具有统计学意义(P<0.01);与mU6/Survivin单质粒组的细胞增殖抑制率相比较，其细胞增殖抑制率明显增大(P<0.01)。计算mU6/Survivin质粒与不同浓度的顺铂的二者合用效应Q值，所有对应浓度点的Q值均>1，具有协同增强作用。DNA电泳结果显示mU6/Survivin质粒在MCF7细胞中对顺铂诱导的DNA裂解没有影响。表1 siRNA表达质粒mU6/Survivin加强顺铂对MCF7细胞的生长抑制 与顺铂单药组对应的各浓度点比较：^P<0.01;与pmU6/survivin单质粒组比较：△P<0.01。
2.2 mU6/Survivin质粒增强环磷酰胺的抑癌作用
结果见表2。在本实验采用的浓度范围内，环磷酰胺单药组对MCF7细胞的生长抑制不明显。但当与mU6/survivin质粒合用时，比较环磷酰胺单药组各对应浓度点，其细胞增殖抑制率明显增大(P<0.01);与mU6/Survivin单质粒组的细胞增殖抑制率(21.16±1.60)%相比较，其细胞增殖抑制率明显增大，差异具有统计学意义(P<0.01)。计算mU6/Survivin质粒与不同浓度环磷酰胺的二者合用效应Q值，所有对应浓度点的Q值均>1，具有增强协同作用。DNA电泳结果显示mU6/Survivin质粒在MCF7细胞中对环磷酰胺诱导的DNA裂解没有影响。
2.3 mU6/Survivin质粒增强5Fu的抑癌作用
结果见表3。5Fu单药能有效地抑制MCF7细胞的生长。当5Fu与mU6/Survivin质粒合用时，比较5Fu单药组各对应浓度点，其细胞增殖抑制率明显增大(P<0.01);与mU6/Survivin单质粒转染组的细胞增殖抑制率相比较，其细胞增殖抑制率明显增大(P<0.01)。计算mU6/Survivin质粒与不同浓度5Fu的二者合用效应Q值，除10 g/L浓度点外，其余各浓度点Q值均>1，具有协同增强作用。DNA电泳结果显示mU6/Survivin质粒在MCF7细胞中对5Fu 诱导的DNA裂解没有影响。表2 siRNA表达质粒mU6/Survivin加强环磷酰胺对MCF7细胞的生长抑制与环磷酰胺单药组对应的各浓度点比较：^P<0.01;与pmU6/survivin单质粒组比较：△P<0.01。 表3 siRNA表达质粒mU6/Survivin加强5Fu对MCF7细胞的生长抑制与5Fu单药组对应的各浓度点比较：^P<0.01;与pmU6/survivin单质粒组比较：△P<0.01。表4 siRNA表达质粒mU6/Survivin加强秋水仙碱诱导的MCF7细胞的生长抑制 与秋水仙碱单药组对应的各浓度点比较：^P<0.01;与pmU6/survivin单质粒组比较：△P<0.01。
2.4 mU6/Survivin质粒对秋水仙碱的肿瘤细胞增殖抑制
