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挑取含重组质粒pET28aSjc HGPRT的BL21(DE3)细菌的单个菌落,接种于3 ml LB/Kan (30 μg/ml)培养液中,37 ℃ 250 r/min振荡培养12 h,1 ml过夜培养菌转种于100 ml LB/Kan (30 μg/ml)培养液中,37 ℃ 250 r/min振荡培养4 h,至D(600 nm)≈0.6时,加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1 mmol/L诱导细菌表达,25 ℃ 250 r/min诱导后4 h,收集培养液,5 000×g离心15 min,弃上清,重悬细菌沉淀于50 ml PBS中,冰浴高强度超声30 s,停30 s,超声3次,10 000×g离心15 min,离心后收集上清,用Qiagen公司的组氨酸亲和层析柱纯化蛋白。SDSPAGE电泳分析目的蛋白,紫外分光光度仪测定蛋白质浓度[D(260 nm)和D(280 nm)]。
1.3 动物免疫
将52只雌性C57BL/6小鼠随机分为5组,第Ⅰ组为感染对照组,第Ⅱ组和第Ⅲ组分别为弗氏佐剂对照组和Montanide ISA 206佐剂对照组,第Ⅳ组为reSjc HGPRT加弗氏佐剂免疫组,第Ⅴ组为reSjc HGPRT加Montanide ISA 206佐剂免疫组。每组10～12只小鼠。第Ⅳ和第Ⅴ组每只小鼠颈背部多点皮下注射乳化的20 μg重组抗原和弗氏或Montanide ISA 206佐剂,共免疫3次,间隔2周。其中第Ⅳ组小鼠第一次注射用佐剂为弗氏完全佐剂(FCA),加强免疫时为弗氏不完全佐剂(FIA)。第Ⅱ组和第Ⅲ组小鼠则同法注射乳化的生理盐水加弗氏或Montanide ISA 206佐剂,感染对照组小鼠不注射任何抗原、佐剂或生理盐水。
1.4 攻击感染
末次免疫后2周,各组每只小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(30±1)条。攻击感染6周后剖杀小鼠,门静脉灌注收集虫体,计算减虫率和减雌雄合抱率。减雌雄合抱率(%)=(1-实验组平均检获雌雄合抱数/对照组平均检获雌雄合抱数)×100%。肝脏称重,加20～40 ml 8%的KOH,37 ℃,250 r/min消化3 h,取100 μl消化液涂片,在4倍光镜下进行虫卵计数,重复涂片3次,取均数,计算每克肝组织虫卵数(EPG)。
1.5 小鼠血清特异性抗体水平检测
分别于第一次免疫前、尾蚴攻击感染前和剖杀前,经小鼠尾静脉采血并分离血清,-20 ℃保存备用。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定小鼠血清中特异性IgG抗体水平。reSjc HGPRT抗原2 μg/孔包被,加含5%小牛血清的0.01 mol/L PBS 37 ℃封闭2 h;加待测小鼠血清(1∶100稀释,稀释液为含5%小牛血清的PBS),37 ℃孵育1 h,用PBST(0.1% Tween20)洗涤3次,每次5 min;加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(1∶1 000稀释),37 ℃孵育1 h;PBST洗涤3次,最后一次以PBS洗涤,加邻苯二胺(OPD)显色液显色,2 mol/L H2SO4 终止反应,测得各组光密度值[D(490 nm)]医学 全在.线提供www.lindalemus.com。
1.6 统计学分析
运用SPSS 11.0统计软件包对数据进行单因素方差分析(ANOVA),并进行t检验。
2 结 果
2.1 reSjc HGPRT重组抗原的鉴定
pET28aSjc HGPRT/BL21工程菌经IPTG诱导表达,表达产物经SDSPAGE分析表明,重组抗原Mr约29 000(含载体的6个组氨酸),纯化的抗原纯度较高(图1),浓度为2.58 mg/ml。
2.2 免疫保护作用
与感染对照组相比, reSjc HGPRT加Montanide ISA 206佐剂免疫组小鼠所检获成虫数最少,减虫率为53.7%(P<0.05); reSjc HGPRT加弗氏佐剂组减虫率次之,为43.3%(P<0.05);Montanide ISA 206佐剂组的减虫率也较低(P<0.05)。reSjc HGPRT加Montanide ISA 206佐剂免疫组雌雄合抱减少率为59.3%;而reSjc HGPRT加弗氏佐剂组与感染对照组相比雌雄合抱减少率为44.1%(P<0.05)。
与感染对照组相比,reSjc HGPRT加Montanide ISA 206佐剂免疫组肝脏减卵率最高,为44.9%(P<0.05)、 reSjc HGPRT加弗氏佐剂免疫组减卵率为33.0%,Montanide ISA206佐剂对照组和弗氏佐剂组也有一定的减卵率(表1)。表1 日本血吸虫HGPRT重组抗原免疫小鼠减虫率、减雌雄合抱率和肝减卵率
2.3 ELISA检测免疫鼠血清特异性抗体(IgG)
末次免疫后7天,重组抗原加弗氏佐剂免疫组和重组抗原加Montanide ISA 206佐剂免疫组小鼠血清中特异性IgG水平明显升高,与感染对照组相比差异有统计学意义(P<0.001);与弗氏佐剂对照组相比,抗体水平差异亦有统计学意义(P<0.001)。而感染对照组小鼠免疫前、免疫后血清中特异性抗体IgG水平无明显变化(P>0.05)。另外攻击感染后各组血清特异性抗体均升高(表2)。表2 ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG抗体: P<0.001,与Ⅰ组相比;b: P<0.001,与Ⅱ组相比;c:P>0.05,d:P<0.01,组内与免疫前相比
3 讨 论
疫苗被作为血吸虫病综合防治重要的措施之一而倍受关注,WHO专家认为,化疗手段(短效)必须与长效的措施(疫苗)相结合[2],才能有效地控制血吸虫病,因此寻找新的疫苗候选抗原是当今血吸虫疫苗研究的热点之一。HGPRT是一种与调控细胞核苷酸代谢有关的酶,在血吸虫的体内有很高的活性,与血吸虫的生长发育有关。HGPRT通过嘌呤核苷酸补救途经形成核苷肌苷酸(IMP)或鸟苷酸(GMP),是血吸虫体内鸟嘌呤和(或)次黄嘌呤合成鸟嘌呤核苷(guanosine monophosphate,GMP)必不可少的一种酶。HGPRT活性的丧失会直接导致寄生虫体内鸟嘌呤的缺乏,从而阻断DNA的合成,使寄生虫细胞不能分裂,无法发育[3,4],从而导致细胞死亡,因而被认为是抗曼氏血吸虫病化疗有希望的靶抗原[5]。近来,在日本血吸虫的疫苗研究中发现,日本血吸虫HGPRT被证明存在于日本血吸虫SIEA中[6]。用日本血吸虫HGPRT重组蛋白免疫昆明鼠的研究发现,其减卵率水平较高[7]。
