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许多研究认为[1-3]椎间盘软骨终板下骨的微循环障碍可致椎间盘营养供给障碍,是椎间盘退变的重要病因之一。因此建立一种可靠的腰椎椎体缺血性实验动物,不仅可以研究脊柱退变的发病机制,而且也可为椎间盘退变的病因治疗提供研究平台[4-6]。椎间盘退变动物模型分为自发性和诱导性两种。自发性椎间盘退变模型是通过系统方法引起动物遗传性状或行为方式改变,最后引起椎间盘退变的发生,诱导性。椎间盘退变模型又分为机械性损害模型和结构性损害模型[7-10]。目前国内未见利用椎体缺血导致椎间盘退变的动物模型建立的报道。本研究通过经皮穿刺新西兰大白兔腰椎终板侧椎体注射平阳霉素,并以MRI及病理学观察腰椎终板及椎间盘的退变。
1 材料与方法
1.1 实验动物与材料
选取36只新西兰大白兔,雌雄不限,平均月龄2个月,质量(3 200 ± 30) g,清洁级,由中山大学动物实验中心提供。每只选取两个椎体作为实验组(第5腰椎,L5)和对照组(第4腰椎,L4)。单笼饲养,室温控制在25 ℃左右。平阳霉素粉针为天津太河制药有限公司生产,8 mg/支;骨穿刺针17 G × 10 cm(德国Angiomed公司)。
1.2 实验动物处理
0.3 g/L戊巴比妥1 mL/kg经兔耳缘静脉注射, 麻醉成功后将兔俯卧于固定板上,腰背部剃毛备皮。在Philips Allura Xper FD20型大平板DSA手术台上消毒铺单,正位透视下,17 G骨穿针在椎体下1/3。正中线右侧旁开约1 cm。与水平方向成角约60°。垂直进针,至针尖达软骨终板侧椎体中心;侧位透视显示针尖位于椎体前2/5与后3/5交界处。以DSA的X线CT穿刺(XperCT)定位功能确认针尖位置。将优维显-300稀释50%,推注1 mL行椎体造影,1 mL生理盐水冲洗针道后静息3 min。实验组注射平阳霉素(2 mg/mL) 1 mL,对照组注射生理盐水1 mL。每次注射持续5 min。拔刺针后按压穿刺点2 min局部消毒包扎。术后3 d,每只兔每天肌注4万单位庆大霉素。
1.3 MRI检查
术后第1。2。3。4。5周及第3月随机选取6只实验动物行MRI检查,使用Simens 3.0T Magnetom TrioTim MR仪扫描;分别行兔脊柱矢状位的脂肪抑制T1WI(Fat Saturation T1WI,FST1WI)。T2WI及脂肪抑制T2WI(Fat Saturation T2WI,FST2WI);扫描参数为:T1WI:TE 12 ms,TR 540 ms,视野(FOV) 200 mm,层厚2 ~ 3 mm;T2WI:TE 100 ms,TR 1 900 ms;测量术后第4周椎体矢状位高信号区面积(长 × 宽,单位:mm2),每个椎体测量四个层面(n = 6 × 4)。
1.4 病理学检查
每次MRI检查后将兔处死,透视下取出L4。L5椎体,大体观察标本颜色。周围软组织反应情况等。标本取与椎体矢状面呈30°剖面,40 g/L多聚甲醛固定一周后,Plank-Rycholo液脱钙5 ~ 7 d,石蜡包埋。切片及再固定,系列酒精脱水,石腊包埋,5 μm组织切片。HE染色。低倍镜下观察腰椎椎体。软骨终板及椎间盘变化,中倍及高倍镜下观察细胞形态及结构,将术后第4周兴趣区标本切片4份(n = 6 × 4);高倍视野下计算每张切片中腰椎椎体病变区面积(长 × 宽,单位:mm2)。
1.4 统计学分析
实验组第4周T2WI高信号区面积(ST2WI)与病理切片病变区面积(Shistology)的相关性采用SPSS13.0软件统计分析。
2 结 果
穿刺过程顺利,注射平阳霉素前的椎体造影可显示椎体的微血管及引流静脉(图1,2);术后所有兔均存活,无截瘫及感染等。对照组MRI及病理学检查均无明显变化。实验组MRI及病理第1 ~ 2周变化不明显,第3周MRI出现FST1WI低信号,T2WI及FST2WI呈稍高信号,第4周信号变化更明显(图3);第3 ~ 4周病理,骨小梁排列杂乱。骨细胞逐渐减少,骨髓内血细胞减少。脂肪细胞增多融合,软骨终板细胞减少。结构紊乱,纤维环及髓核无明显变化,第5周病理出现软骨终板和椎间盘退变表现:软骨终板细胞坏死,髓核及纤维环结构破坏(图4)。第3月软骨终板侧椎体缺血持续存在,软骨终板和椎间盘退变更为明显(图5)。实验组第4周T2WI高信号区面积(ST2WI)与病理切片病变区面积(Shistology)的统计分析结果显示,两者间存在明显的正相关性(r = 0.965,P < 0.001;表1)。
3 讨 论
椎间盘退变是腰腿痛和下腰痛的重要原因之一,也是腰椎间盘突出症和其他腰椎疾患的病理基础[11]。椎间盘退变实验动物可为退变椎间盘的修复研究提供良好的实验载体。椎间盘退变实验动物分为两大类:诱发性和自发性。其中以鼠。兔及犬制作的诱发性模型应用最为广泛,包括通过改变椎间盘生物力学环境。损伤椎间盘自身结构以及应用基因技术改变动物的遗传性状等诱发退变。这些方法均为外界人为因素直接作用于椎间盘本身。创伤较大。本研究采用经皮穿刺兔腰椎终板侧椎体,注射去血管化平阳霉素造成椎体微循环的破坏,形成软骨终板侧椎体缺血,进而引起腰椎终板及椎间盘的退变,具有操作简便。创伤小及不直接损伤椎间盘结构的优点医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
平阳霉素作用是干扰血管内皮细胞的生长代谢,抑制细胞内的DNA合成。造成内皮细胞变性和增生,最终血栓形成从而引起血管供血部位的缺血[12]。本实验中,实验组注射平阳霉素,第3周病理显示骨小梁排列杂乱, 骨细胞逐渐减少;骨髓内血细胞减少,脂肪细胞增多。融合;软骨终板内细胞减少。结构紊乱。而纤维环及髓核无明显变化。第4周时上述病理变化更加明显,但无椎间盘退变表现。与同期的对照组比较,可排除穿刺本身对实验动物影响的可能。第1周和第2周的阴性结果提示,药物没有直接作用于软骨终板和椎间盘。术后前4周,平阳霉素造成软骨终板侧椎体微血管及血窦内皮细胞的逐渐损伤,进而影响骨细胞及软骨终板细胞的营养供给及代谢,腰椎终板逐渐发生退变。第5周椎间盘细胞的营养障碍加重,椎间盘退变开始出现;术后第3月,软骨终板侧椎体缺血改变持续存在,腰椎终板及椎间盘退变更为典型。这表明软骨终板侧椎体缺血对终板及椎间盘退变有着直接的作用。
