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1 材料与方法
1.1 药物、试剂及仪器 布瑞宁(注射用葛根素，北京四环科宝制药有限公司，0.1g/支，批号H20010776)。CK、NO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，ET检测试剂盒购自天津九鼎医学生物工程公司。动物呼吸机(成都泰盟科技公司)，BL420E生物机能实验系统(成都泰盟科技公司)，紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)。
1.2 心肌I/R大鼠模型 阻断LAD 血流造成缺血45 min，然后再灌注120 min[5,6]制作大鼠动物模型，以心电图出现QRS波群高大增宽为结扎成功标志，以QRS波群振幅逐渐回落为再灌注成功标志。
1.3 实验分组 Wistar大鼠24只，雌雄不拘，体重200～250 g，随机分为4组，每组6只。(1)sham组：在LAD下穿线但不结扎，给予等量生理盐水尾静脉注射;(2)I/R组：缺血45 min，再灌注120 min，等量生理盐水尾静脉注射;(3)PUEA组：缺血前5 min尾静脉缓慢推注PUE(100 mg/kg体重)，随即进行I/R处理;(4)PUEB组：再灌注前5 min尾静脉缓慢推注PUE(100 mg/kg体重)，随即进行I/R处理。
1.4 血清CK活力、NO含量血浆和ET浓度 再灌注结束后，股动脉取血1.5 ml，4 ℃3 600 r/min离心15 min分离血清，严格按照试剂盒说明书检测血清CK活力。血清NO含量测定：按上述方法分离得到血清后，按试剂盒说明书检测血清NO含量。再灌注结束后股动脉取血2 ml，注入含7.5%EDTA·Na2 30 μl和抑肽酶40 μl的试管内混匀，4 ℃ 3 600 r/min离心15 min，分离血浆，送内分泌实验室测定血浆ET浓度。
1.5 心肌梗死面积测定 再灌注结束后迅速取出心脏，原位结扎LAD，经主动脉逆行灌注Evan蓝1～2 ml，分离非缺血区和缺血区，用滤纸吸干后称重，再将缺血区沿垂直于心脏纵轴方向切开，每片厚1～2 mm，置于1%TTC磷酸缓冲液(pH 7.4) 37 ℃孵育20 min，随后分离坏死区(灰白色)和非坏死区(砖红色)，滤纸吸干后分别称重。梗死面积以坏死心肌重量与缺血区心肌重量之比表示，缺血面积以缺血区重量与全心重量之比表示。
1.6 数据分析 所有数据以(x±s)表示，用SPSS 10.0统计软件包进行分析，多组间均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性医.学.全.在.线www.lindalemus.com。
2 结果
2.1 心肌梗死面积 除sham组外，各组间缺血面积无明显差异(P>0.05)。sham组未发生心肌梗死，I/R组左室心肌梗死面积达最多，PUEA、B组心肌梗死面积较I/R组明显减小，表明缺血前和再灌注前给予葛根素均可以显著缩小缺血再灌注引起的心肌梗死范围，且二者效应相似。见表1。表1 各组心肌缺血面积和梗死面积
2.2 血清CK活力变化 I/R组CK活力较sham组明显升高(P<0.05)，PUEA、B两组CK活力较I/R组均明显降低(P<0.05)，而且PUEA、B两组间比较亦无显著差异(P>0.05)。因此，缺血前和再灌注前给予葛根素预处理均可降低心肌缺血再灌注损伤时血清CK活力。结果见表2。表2 各组血清CK活力变化
2.3 血浆ET浓度、血清NO及比值变化 与sham组相比，I/R组ET浓度升高，NO浓度明显降低，ET/NO比值升高显著(P<0.05)。与I/R组相比，PUEA、B两组较I/R组ET浓度降低，NO浓度升高，ET/NO比值明显降低(P<0.05)，两组与sham组各值比较差异无显著性(P>0.05);PUEA、B两组间亦差异不显著(P>0.05)，见表3。表3 各组血浆ET及血清NO浓度变化注：(1)与sham组比较，P<0.05;(2)与I/R组比较，P<0.05。
3 讨论
心肌缺血-再灌注损伤的机制复杂，目前认为与能量代谢障碍、自由基的作用、细胞内钙超负荷、无复流现象及白细胞的作用等有密切关系。现已公认，预处理，比如IPC、PPC、低氧预处理(hypoxic preconditioning，HPC)可对缺血-再灌注造成的组织器官损伤产生明显的保护作用，因此，利用药物代替IPC诱导再灌注损伤保护作用有潜在的临床应用价值。
葛根为豆科属植物，含异黄酮成分葛根素及葛根素木糖甙等，其药理作用与黄酮相似，对心血管系统具有广泛的药理作用。葛根素可以使冠脉扩张，减少血小板聚集，改善微循环;具有β受体阻滞作用以及钙离子拮抗剂的电生理样作用，减慢心率，使心肌耗氧量下降;调节血浆NO/ET比值，改善血管内皮细胞功能;抗氧化、清除自由基作用，从而保护缺血心肌的功能[7]。本实验采用结扎LAD的方法复制大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型，通过观察血清CK活力、血浆ET浓度、NO浓度及心肌梗死面积等指标，比较缺血前和再灌注前给予葛根素治疗的缺血-再灌注损伤的保护效应是否有差异。实验结果显示，与sham组比较，大鼠心肌经过45 min缺血和120 min再灌注后发生了明显的损伤，表现在血清CK活力增高及明显心肌梗死区域。心肌缺血-再灌注后血浆ET浓度明显增加，这与文献报道一致[8]，与此同时血清NO浓度降低、ET/NO比值增大，表明心肌细胞严重受损，同时还存在冠状动脉内皮细胞的明显损伤，因为ET和NO是血管内皮细胞分泌的血管活性物质，ET收缩血管，NO松弛血管平滑肌，两者正常情况下保持动态平衡，其水平可以反映血管内皮功能状态。大多数文献资料以及以往的研究都已表明，在缺血前给予葛根素预处理能对心肌的缺血-再灌注损伤发挥明显的保护作用。本实验结果表明，葛根素缺血前给药能使ET浓度降低、NO浓度升高，从而ET/NO保持平衡，葛根素可通过改善血管内皮细胞，发挥明显的抗心肌缺血-再灌注损伤保护作用。此外，本实验结果还表明，再灌注前给予葛根素治疗同样可以产生效应相似的心脏保护作用，表明不同时机葛根素治疗均可以产生保护效应，即都能产生PPC效应。有报道认为，再灌注前给予葛根素能明显减少再灌注引起的细胞凋亡，而缺血前给药抑制细胞凋亡的效果并不明显[9]。推测这些结果的差异可能与葛根素缺血前抑或再灌前给药发挥心肌保护作用的机制有所差异有关，此外也可能和实验过程中所使用的研究方法和研究材料差异有关。
