 |
 |
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
FTZ提取物 称取FTZ处方药材(由女贞子、丹参、三七、黄连等按2∶1∶0.5∶0.5质量比组成)，置圆底烧瓶中，加70%(φ)乙醇8倍量，浸泡0.5 h，加热回流提取1.5 h，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩，浓缩液备用;药渣加水8倍量，加热回流提取1.5 h，滤过，浓缩，合并浓缩至3 g生药/g浸膏,临用时用0.1 mmol/L TrisCl缓冲液溶解稀释至相应浓度。
三七总皂苷、人参皂苷Rb2、齐墩果酸、盐酸小檗碱、丹参素由中国药品生物制品检定所提供;总脂酶试剂盒(南京建成生物工程研究所);大鼠肝脂酶的ELISA测定试剂盒(武汉中美科技);磷酸盐等试剂均为国产分析纯试剂; 盐酸氯丙嗪(Sigma公司);十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫代苏糖醇(DTT)(Amresco)。
1.2 实验动物
Spague Dawley(SD)大鼠,由广东省实验动物中心提供，雄性，体质量200～250 g，符合SPF级标准，合格证号：检证字2009A056医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
1.3 主要仪器
SPECORD S600分光光度计(德国耶拿)、BIOTEK Elx800酶标仪(美国BIOTEC)、HC3018R离心机(科大创新)、高速冷冻离心机(EPPENDORF)、高速匀浆机(IKA)。
2 方 法
2.1 大鼠肝脏匀浆制备及HL含量测定
取健康雄性大鼠，禁食一晚，乙醚麻醉后断头处死大鼠，迅速取出肝脏,在冰浴上剪成碎块，用4 ℃预冷的生理盐水洗去血液，用4 ℃预冷的0.1 mol/L TrisHCl( pH=9.5)在冰水浴中制成10%(1 g/10 mL)的匀浆,组织匀浆至显微镜下无完好细胞，低温下8 000 r/min离心5 min，取脂层下清液，加入DTT至1 mmol/L，保存于-70 ℃冰箱中备用。Bradford法测定肝匀浆中蛋白质含量,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定匀浆中HL酶蛋白含量。
2.2 肝组织匀浆中HL活力的比色测定方法
HL活性测定是以脂肪乳剂为底物,在37 ℃、pH 9.5 条件下与一定量的肝匀浆37 ℃水浴保温30 min，肝匀浆中的HL可将底物中的TG 水解为甘油和游离脂肪酸(free fatty acid,FFA),用有机溶剂二次提取FFA，铜试剂比色法测定生成的FFA 含量,计算反应体系肝匀浆中肝脂酶的比活性[1 U=1 μmol/L FFA/(h·mg)，即每毫克匀浆蛋白每小时在反应系统中催化生成1 μmol/L的FFA定义为1个酶活性单位][8，9]。
三酰甘油乳剂：0.82 mL三油酸甘油酯，1 g阿拉伯胶，1.5 g白蛋白加含1 mol/L NaCl、 0.005 mol/L Ca2+的0.1 mol/L pH9.5 TrisHCl缓冲液至100 mL，制成乳剂。
酶活力测定反应体系总体积为1 mL，包括0.1 mol/L TrisHCl 0.74 mL (pH=9.5，Ca2+5 mmol/L)，20% BSA 0.1 mL,脂肪乳剂10 μL,10 mol/L NaCl 0.l mL,肝组织匀浆上清液50 μL。
2.3 大鼠肝匀浆HL酶活性测定条件的优化
2.3.1 匀浆量对大鼠肝HL活性的影响 配制pH值9.5的TrisHC1系统，加入相关的试剂，分别加入5、10.0、20.0、30.0、50.0 μg/mL的肝匀浆，按上述方法操作，测定加入不同肝匀浆量的HL活性，确定测定肝匀浆中HL活性的最佳匀浆量。
2.3.2 反应体系pH对大鼠肝HL活性的影响 配制不同pH值的TrisHC1系统，加入50 μL的肝匀浆和相同量的相关试剂，按上述方法操作测定不同pH值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)的TrisHCl反应系统中肝匀浆的HL活性，确定测定肝匀浆中HL活性的最佳pH条件。
2.3.3 温度和DTT对酶活性影响 收集肝组织匀浆后立即测定肝脂酶活性,然后分别测定25 ℃、4 ℃、-20 ℃、-70 ℃下保存24 h的肝脂酶活性，并测定加终浓度为1 mmol/L的DTT 肝组织匀浆在 4 ℃、-20 ℃，-70 ℃保存24 h、30 d时的HL活性。
2.3.4 反应时间对肝匀浆HL活性的影响 在pH9.5的TrisCl反应体系中，分别加入50 μL 肝匀浆，37 ℃分别温育0、10、30、60、90、120 min，测定HL活性，确定肝匀浆中HL活性与反应时间的关系。
2.3.5 激活剂钙浓度对肝匀浆中HL活性的影响 在pH9.5的的TrisCl反应体系中，分别加入不同量的1 mol/L EGTA溶液，使体系中游离钙浓度(Ca2+)分别为0.001、0.005、0.025、0.10 mol/L,然后分别加入50 μL的肝匀浆，按上述方法操作测定不同pH钙浓度下系统中肝匀浆的HL活性，确定钙浓度对肝匀浆中HL活性的影响。
