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1 材料与方法
1.1 主要试剂
雷帕霉素(rapamycin，福建省微生物研究所)，环孢素A(CsA，Novartis公司)，普乐可复(FK506，日本藤泽制药公司)，5氟尿嘧啶(5Fu，上海旭东海普药业有限公司)，噻唑蓝(MTT，Sigma公司)，Coulter DNAPrep Reagents Kit(Beckman Coulter公司)，Quantikine Mmouse VEGF Immunoassay试剂盒(R&D Systems公司)，Rat AntiMouse CD34(Southern Biotechnology Associates, Inc.)等。
1.2 方法
1.2.1 噻唑蓝比色实验(MTT)
体外培养小鼠H22肝细胞癌株，分别与不同浓度的RPM(0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L)、CsA(1mg/L)、FK506(0.1mg/L)和5Fu(10mmol/L)在96孔培养板共同孵育48h后，每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，继续孵育4h，终止培养，离心后弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，振荡10min，使活细胞内的蓝紫色结晶物充分溶解。选择490nm波长，以酶联免疫检测仪检测各孔的吸光度值(A)，记录结果医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
1.2.2 细胞的周期变化测定
体外培养小鼠H22肝细胞癌株分别与不同浓度的RPM(0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L)、CsA、FK506和5Fu在24孔培养板共同孵育48h后终止孵育，700mL/L的冷乙醇固定60min。离心，PBS洗涤2次，加100μL的PBS重悬细胞，每份待检细胞数1×106，分别加入DNAPrep Stain 400μL，常温下染色20min。离心洗涤后将样品用300目尼龙膜过滤。用流式细胞仪检测，multicycle分析软件对样本进行细胞周期分析。
1.2.3 VEGF含量的测定
用ELISA法测定各组上清液中VEGF含量。将培养瓶内对数生长的小鼠肝癌细胞H22，以含20mL/L小牛血清的RPMI1640细胞培养液配成1×108 cells/L的细胞悬液，以每孔2×104 cells、200μL接种于96孔培养板上孵育24h，离心弃去孔内上清液，按实验设计以含不同浓度药物的培养液分别加入各孔内，每一浓度重复6孔，孵育48h。离心，每孔吸取100μL上清液作为测试样品-80℃冷冻保存备用。依照试剂说明准备所有的试剂、工作标准品和样品，通过分光光度仪读取各孔的A值，并依此值绘制标准曲线，计算各孔内样品的VEGF浓度。
1.2.4 体内实验
各组小鼠首先建立H22肝细胞癌皮下移植瘤模型，皮下移植瘤模型建立后当天完成C57BL/6小鼠→BALB/c小鼠异体皮肤移植。RPM[1.5mg/(kg·d)、4.5mg/(kg·d)]、CsA[20mg/(kg·d)]、FK506[5mg/(kg·d)]和5Fu[50mg/(kg·d)]灌胃14d，观察皮片存活情况，模型建立24d剖杀小鼠，留取血清及肿瘤组织。计算各组肿瘤体积，ELISA法测定各组小鼠血清中VEGF含量，通过CD34免疫组化染色测定各组肿瘤组织的微血管密度(MVD)。对照组用CMCNa 0.005mg/mL灌胃。
1.2.5 统计学方法
采用SPSS11.0统计软件，实验数据采用均数±标准差(±s)表示，组间比较用方差分析、LSD检验、Dunnet t2 t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
