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1 材料与方法
1.1 实验动物来源及分组
雄性SD大鼠36只,体质量150～200g,由广东医学院实验动物中心提供。随机分为正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、姜黄素治疗组(C组)各12只。
1.2 试剂与药品
98%纯度姜黄素由广东医学院天然药物开发中心提供。卵白蛋白(Ovalbumin,OVA,V级):美国Sigma公司; GM-CSF探针由上海生物工程技术有限公司合成，探针序列为3-CTGACGACCCTCGCTGGT-CAGGTCC-5'。
1.3 模型的建立
参照文献[3]方法进行。实验的第1、3天,B、C组大鼠腹腔注射抗原液1ml(含卵蛋白100mg,灭活百日咳杆菌疫苗5×109个,氢氧化铝干粉100mg)致敏, A组用等量的生理盐水替代抗原液。第10天后,B、C组以1%卵蛋白溶液雾化吸入,30min激发,动物出现打喷嚏、呼吸频率加快、幅度加大、腹式呼吸明显等症状。以后每天激发1次,共15次。C组大鼠于每次激发前20min胃饲姜黄素200mg/kg药液,B组大鼠鼻饲等量生量盐水。第24天取材。
1.4 标本采集
末次激发后2～4h内处死大鼠。开胸,取右肺脏冷生理盐水清洗后,置于-60℃冻存备用。
1.5 肺泡灌洗液总细胞数及嗜酸性粒细胞计数
气管插管，用生理盐水5ml注入左侧气管肺组织内，反复抽吸3次，回收率80%以上，将抽取得肺泡灌洗液取20μl用以细胞记数，剩余放入离心管中，100r/min，离心后沉淀用1ml生理盐水稀释，涂片，瑞氏-姬姆萨染色计数100个细胞观察细胞分类情况。
1.6 肺组织GM-CSFmRNA原位杂交检测
取肺组织冰冻切片,0.1MPBS漂洗5min,0.3%TritonX-100 20min,蛋白酶K(2ng/ml)37℃,30min,4%多聚甲醛5min,(1.33%三乙醇胺+0.25%乙酸酐)/0.1MTris-HCL,pH 8.0 10min,2×SSC漂洗10min,杂交液(每片加含有GM-CSF探针标记液20μl),45℃下,20h,4×SSC,37℃下、15min,2×SSC,37℃下,30min,依次转入1×SSC、0.5×SSC,37℃下各10min,0.5MPBS漂洗5min,加Anti-Dig-Ap抗(1∶1000)37℃下,1h,转入4℃下,20h,TSM1、TSM2各10min,NBT/BCIP显色3～4h,0.05MPBS漂洗,终止反应,中性树胶封片。杂交前所需液体及试剂均需DEPC无RNAase处理医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
1.7 统计学方法
结果以(x±s)表示,应用sas 8.1软件包进行单因素方差分析、F检验、相关分析。P<0.05认为组间有显著性差异,P<0.01认为组间有极显著性差异。
2 结果
2.1 大鼠哮喘症状发作程度
于第1次激发后,B、C组大鼠出现明显呼吸变促、烦躁、打喷嚏等症状。连续抗原激发后,B组大鼠症状严重,即刻出现喷嚏,烦躁不安,呼吸急促,有喘鸣音,严重者出现行动迟滞,反应迟钝,且持续时间长。A组无症状,C组大鼠症状较轻,表现为气促、烦躁。
2.2 哮喘大鼠肺泡灌洗液总细胞数及嗜酸性粒细胞计数
哮喘模型组总细胞数及嗜酸性粒细胞数均明显高于姜黄素组及对照组，差异有统计学意义(P<0.01),见表1。表1 各组大鼠肺泡灌洗液总细胞数及嗜酸性粒细胞计数情况 (略)
