 |
 |
1.2 检测方法 采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶联结免疫组化(SP)法进行实验检测。基本原理是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。鼠抗人HPV16E6单克隆抗体、即用型鼠SP kate检测试剂、DAB显色试剂盒、SP试剂盒均为北京中山生物技术有限公司产品。本实验染色程序严格按SP染色试剂盒说明书操作。
1.3 免疫组化结果判断标准 根据文献，按阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱评分(immunohistochemical scores，IHS)[5]： IHS=a×b。a代表阳性细胞百分比：a=0，无阳性细胞;a=1，阳性细胞为1%～10%;a=2，阳性细胞为11%～50%;a=3，阳性细胞为51%～80%;a=4，阳性细胞为81%以上。b 代表阳性细胞染色强弱：b=0，阴性;b=1，弱阳性;b=2，中度阳性;b=3，强阳性。IHS 0分为(-);IHS 1～4分为(+);IHS 5～8分为(++);IHS 9～12分为(+++)。HPV16E6蛋白阳性细胞以胞核内出现棕黄色颗粒为主，部分出现在胞浆中。每张切片均以IHS评价得分情况。每批染色均同步设立对照，以PBS液代替一抗为阴性空白对照。
1.4 统计学分析 应用SAS 8.1统计软件，计数资料采用χ2检验、确切概率法、多个样本率比较的χ2分割法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HPV16E6蛋白在不同宫颈病变组织中的表达 HPV16E6染色阳性以胞核内出现棕黄色颗粒为主，部分出现在胞浆中，其在正常宫颈、宫颈炎、CIN、宫颈癌各组中的阳性表达率分别为0.5%、38.35%、46.15%、71.11%，4组比较差异有统计学意义(χ2=27.50，P<0.01)。经χ2分割后比较(α′=0.007143)，宫颈癌组的阳性率明显高于宫颈炎组及正常宫颈组(χ2=11.95，P=0.0005;χ2=25.21，P<0.01)。CIN组明显高与正常宫颈组(χ2=9.95，P=0.0016)。宫颈炎组明显高于正常宫颈组(χ2=8.63， P=0.0033)。而宫颈癌组与CIN组，CIN组与宫颈炎组阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=4.35， P=0.0369;χ2=0.4841，P=0.4866)。CIN组及宫颈炎组内重度病变阳性率明显高于轻度病变(χ2=11.17，P=0.0008)。见表1、2。表1 HPV16E6在 CC、CIN、Cc正常宫颈组织中表达比较 表2 χ2分割后HPV16E6阳性表达率比较
2.2 HPV16E6蛋白的表达与宫颈癌临床病理参数之间的关系 HPV16E6的阳性率在宫颈癌组织中的表达与组织学分级、临床分期、有无淋巴结转移、肿瘤直径、肌层浸润深度差异无统计学意义(P>0.05)。在<45岁和≥45岁患者中分别为57.65%、89.47%，二者比较差异有统计学意义(χ2=5.39，P<0.05); 在鳞癌与非鳞癌中分别为88.24%、18.18%，二者比较差异有统计学意义(χ2=16.59，P<0.05);有宫旁或脉管浸润与无宫旁或脉管浸润的组织中分别为89.47%、57.69%，二者比较差异有统计学意义(χ2=5.40，P<0.05)。见表3。表3 HPV16E6蛋白表达与宫颈癌的关系和临床病理特征
3 讨论
HPV为乳多空病毒科A属成员，由无被膜的正20面体构成病毒壳体，是7 900 bp环状、双链、右手螺旋、嗜上皮性的DNA病毒[6]。钱元淑等[7]用PCR法检测HPV16/18在宫颈癌及其癌前病变中的表达情况。结果显示：HPV16/18阳性率在正常宫颈到宫颈炎、CIN、再到宫颈癌有逐渐升高趋势。宫颈癌组与CIN组、CIN Ⅲ与CINⅠ～Ⅱ级、中重度宫颈炎组与轻度宫颈炎组差异有统计学意义。本研究中用χ2分割法处理后，宫颈癌组阳性率显著高于宫颈炎组及正常宫颈组，CIN组和宫颈炎组阳性率显著高于正常宫颈组。提示：从正常宫颈向CIN及宫颈癌的转化是一个渐进的过程，而高危型HPV16感染是宫颈细胞恶性转化的重要因素，是宫颈病变发生的早期事件。本实验中，经χ2分割后，宫颈癌组与CIN组的阳性率无统计学意义，分析可能与CIN组样本例数少有关，但CIN Ⅲ级显著高于CINⅠ～Ⅱ级，中重度宫颈炎显著高于轻度宫颈炎，提示：HPV16感染在宫颈病变早期发挥作用，且阳性率有逐渐增高趋势。与文献报道[8，9]结果相似。目前大量研究发现：高危型HPV DNA整合[10]到宿主基因组将导致宿主细胞产生抑癌基因功能缺陷、基因组不稳定性和细胞永生化等一系列不可逆的链式反应，是宫颈癌变的重要机制之一。高危型HPV从肿瘤的启动、发生、发展及恶性表型的全过程都密切相关。由此可见，HPV16感染在宫颈癌的发生、发展中发挥重要作用。本研究显示：在宫颈癌组织中HPV16E6蛋白的阳性表达率与宫旁或脉管浸润有关(P<0.05)。关于HPV感染对宫颈癌侵袭能力的报道较少。研究显示：与HPV感染相关的高级鳞状上皮内病变及恶性肿瘤中E6和E7蛋白的表达水平显著提高，表明E6和E7蛋白的表达水平与病变的进展程度及细胞的恶性转化密切相关。特定的HPV16E6变异可能具有较高的宫颈癌患病风险[11]。诸多研究证明端粒酶的激活与宫颈异型增生和宫颈癌的进展过程有关[12-14]。HPV16E6可提高端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase， hTERT)mRNA的水平，激活端粒酶，是CIN向宫颈癌转化过程中的关键步骤，其阳性表达率随宫颈癌前病变的进展逐渐升高，与宫颈癌的级别呈正相关[15]。同所有实体肿瘤一样，宫颈癌的发生、发展和转移呈明显的血管依赖性。血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factors C，VEGFC)在多种肿瘤细胞中表达，具有诱导血管和淋巴管生成的潜能，促进肿瘤的侵袭和转移。多项研究显示[16-18]：VEGFC与高危型HPV癌蛋白在宫颈癌中的表达呈正相关，推测高危型HPV可能在整合入宫颈上皮细胞DNA后，通过促进宫颈上皮高表达VEGFC导致肿瘤内及癌旁组织新生血管及淋巴管的形成，从而促进宫颈癌的侵袭转移。上述因素协同作用，促进病毒基因组的复制和繁殖，使含有整合状态的病毒癌基因的细胞不断的增殖。这与本研究HPV16E6蛋白与宫旁或脉管浸润有关一致。提示：高危型HPV E6蛋白在促进宫颈上皮癌变过程中扮演重要角色，HPV16在宫颈癌的侵袭转移中发挥一定作用医.学.全.在.线www.lindalemus.com。
