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1.1 实验动物的选择和分组
选用由四川大学动物实验中心提供的健康成年新西兰大白兔36只，体重为2.3～2.5 kg，雌雄不限。采取自身对照设计，在双侧咬肌区分别植入不带骨膜自体桡骨，一侧在骨髓腔内植入颌外动脉（实验侧)，对侧不植入动脉（对照侧)，左右侧不限。手术后3 d、1周、2周、3周、4周、6周各处死动物6只，取材。其中3只用于墨汁灌注和常规组织学检测，另3只用于CD34免疫组化染色。
1.2 手术方法
将实验动物用0.3 g/L戊巴比妥钠耳静脉麻醉，常规脱毛，将其仰卧于手术台上，四肢固定。常规消毒铺巾，于一侧咬肌前缘皮肤作2.5 cm长纵行切口，暴露并游离一段长2.0 cm颌外动脉，钳夹剪断并结扎远端。无菌条件下行一侧前肢中段外侧纵行切口约2.0 cm，暴露桡骨，环行剥离骨膜显露桡骨，横行切断桡骨中段，长约2.0 cm。将游离的动脉近心端自桡骨骨髓腔穿入，固定并植入邻近咬肌中（桡骨在空气中的暴露时间不超过15 min)，庆大霉素生理盐水反复冲洗术野，严密缝合肌层及皮肤。对照侧直接将另一侧游离桡骨植入咬肌区。缝合双侧前肢切口。术后6 d使用青霉素，肌注20万单位，每天2次。手术后8 h给实验动物进食，单独喂养。
1.3 检测方法
1.3.1 移植骨的组织学检测 术后3 d、1周、2周、3周、4周、6周各处死3只实验动物，切取移植骨板，标本经10％中性甲醛溶液固定，10％乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)溶液脱钙，按常规组织学方法制成连续石蜡切片，片厚5 μm，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE)染色。
1.3.2 移植骨血管墨汁灌注 灌注液选用70％墨汁右旋糖苷（70 mL中华牌墨汁和30 mL低分子右旋糖苷)。采用颈动静脉插管，将肝素生理盐水缓慢注入动脉管，待颈静脉导管内流出清亮液体后即可缓慢注入70％墨汁右旋糖苷，灌注压力不超过16.0 kPa。待兔头面颈部变均匀浓黑后立即解剖取下双侧咬肌区桡骨，10％中性甲醛溶液固定，制成脱钙石蜡切片（5 μm)，HE染色，观察再血管化情况。
微血管密度（microvessel density，MVD)的测定参照Weidner法[1]：对墨汁灌注标本组织切片进行图像采集，切片在40倍光镜下挑选微血管分布最高区域，在200倍视野下计数5个视野的被墨汁染成黑色的血管数目，取其平均值作为MVD，每一个与邻近的微血管明显分离的黑色血管内皮细胞或血管内皮细胞簇都视为独立的微血管。
1.3.3 移植骨微血管CD34免疫组化染色 术后3 d、1周、2周、3周、4周、6周各处死3只实验动物，切取移植骨板，标本经70％乙醇固定，80％、90％、95％、100％乙醇逐级脱水，甲基丙烯酸甲脂包埋、切片，片厚5 μm。切片经常规烤片、脱塑至水，免疫组化SABC法抗CD34抗体染色，苏木素复染，加拿大树胶封片，光镜下进行观察。
CD34以血管内皮细胞胞质呈棕褐色为阳性表达，对CD34免疫组化染色切片进行图像采集，切片在40倍光镜下挑选微血管分布最高区域，在200倍视野下计数5个视野的被染成棕褐色的血管数目，取其平均值作为MVD，每一个与邻近的微血管明显分离的染成棕褐色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇都视为独立的微血管。
1.3.4 组织学切片图像分析 术后3 d、1周、2周、3周、4周、6周各个时间点，实验侧从3个脱钙标本和3个不脱钙标本中分别随机抽取2张组织学切片，共计12张，每一张切片再随机选取5个视野，每个时间点脱钙和不脱钙切片分别为30个观察样本数；对照侧选片同实验侧，每个时间点脱钙和不脱钙切片分别为30个观察样本数。用Nikon DXM1200显微镜对切片进行观察，SPOT Cool CCD摄像头采集图像进入计算机，采用Image-Pro Plus 6.0版本专业图像分析软件对数码图像进行分析医.学.全.在.线www.lindalemus.com。
1.4 统计学分析
采用SPSS 12.0统计软件包分析数据，组间比较采用t检验，组内比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA)，组内两两比较采用LSD-t检验。
2 结果
2.1 移植骨HE染色及血管墨汁灌注观察结果
术后3 d，实验侧移植骨髓腔内出现炎症细胞浸润，成纤维细胞生长，髓腔和骨板见少量墨汁充盈；对照侧移植骨髓腔内出现炎症细胞浸润，成纤维细胞生长，髓腔和骨板未见墨汁充盈。术后1周，实验侧移植骨髓腔内炎症细胞聚集，成纤维细胞增多，骨细胞位于陷窝内，髓腔和骨板见墨汁充盈增多；对照侧移植骨髓腔和骨板仍未见墨汁充盈，部分骨陷窝空虚。术后2周，实验侧移植骨髓腔内炎症细胞聚集，胶原纤维呈不规则、紊乱排列，成骨细胞活跃，髓腔和骨板仍见墨汁充盈较多；对照侧移植骨髓腔和骨板见少量墨汁充盈。术后3周，实验侧移植骨哈佛管扩大，胶原纤维排列有序位于骨小梁周围，骨形成和吸收活跃，髓腔和骨板仍见墨汁充盈；对照侧移植骨髓腔和骨板仍见少量墨汁充盈，哈佛管扩大。术后4周，实验侧移植骨哈佛管进一步扩大，胶原纤维明显增多，骨小梁形成，髓腔和骨板见大量墨汁充盈，哈佛管内可见多根血管充盈墨汁，骨吸收陷窝内血管充盈墨汁（图1)；对照侧移植骨髓腔和骨板见墨汁充盈增多，哈佛管内可见血管充盈墨汁，骨吸收陷窝内见血管充盈墨汁（图2)。术后6周，两侧移植骨髓腔内炎症细胞减少，胶原纤维充满髓腔，排列有序，骨改建中，髓腔和骨板见墨汁充盈，但数量减少。
