 |
 |
1 材料与方法
1.1 主要实验仪器和材料
新西兰兔(西安交通大学医学院实验动物中心提供)，光学显微镜(Nikon，日本)，荧光显微镜(Olympus，日本)，DMEM-F12培养基、胰蛋白酶、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记山羊抗小鼠IgG(Gibco，美国)，胎牛血清(北京，元亨圣马)，正常山羊封闭血清液、DAB显色液、山羊抗小鼠IgG-HRP(北京中山金桥)，碘化丙啶(Sigma，美国)，MMP(Chemicon, 美国)，硫酸软骨素酶ABC、单克隆抗体3-B-3、BC-4、BC-13 (英国加的夫大学Bruce Caterson教授提供)。
1.2 松质骨骨基质明胶的制备
取4～5月龄新西兰兔长骨干骺端以及髂骨处松质骨，按文献[9]方法制备松质骨骨基质明胶(bone matrix gelatin, BMG)。将制备的松质骨修成直径约3mm、厚3mm的圆柱状，环氧乙烷灭菌后存于-30℃备用。
1.3 组织工程软骨移植修复膝关节骨软骨缺损
取28d新西兰幼兔1只，无菌条件下分离肱骨、股骨和胫骨关节面软骨，体外单层原代培养[10]后收集细胞，制成107/mL的细胞悬液，按106/管接种到已经放有松质骨BMG的10mL离心管内，静置2h后加入4mL含150mL/L胎牛血清的DMEM-F12培养液，培养2周后移植修复兔股骨内侧髁骨软骨缺损(直径3mm，深3mm;n=6)，术后兔子笼内自由活动。
1.4 组织学染色
手术后6个月取股骨髁修复组织标本，甲醛溶液固定24h，EDTA脱钙1月左右，系列乙醇脱水，石蜡包埋，5μm切片，进行苏木苏-伊红(HE)、甲苯胺兰(TB)、天狼猩红、蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、MMPs降解表位BC-4、aggrecanases降解表位BC-13的染色。
1.4.1 3-B-3(-)、BC-13、BC-4免疫荧光染色
石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。于2mL/L Triton X-100室温下25min;加入0.1u硫酸软骨素酶ABC 37℃孵育45min(3-B-3无此步骤);加50mL/L山羊正常血清封闭液以消除非特异性染色，室温45min，吸去多余液体，不洗;滴加一定比例稀释的一抗(3-B-3、BC-13、BC-4)，4℃过夜(18h以上);37℃复温45min后加入1∶100稀释的FITC标记的二抗，37℃孵育45min;加碘化丙啶复染细胞核，5min。上述各步间均用PBS缓冲液浸洗3次，每次5min。碳酸盐-甘油封片剂封片，荧光显微镜下观察。
1.4.2 MMPs免疫组织化学染色
石蜡切片，常规脱蜡和水化后，2mL/L Triton X-100室温25min;3mL/L H2O2(甲醛配制)室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性;1g/L胰蛋白酶37℃湿盒孵育30min;50mL/L山羊正常血清封闭液37℃ 45min，吸去多余液体，不洗;滴加1∶1000稀释的MMP单克隆抗体，4℃过夜(大于18h);37℃复温45min后加入1∶100稀释的HRP标记的二抗，37℃孵育45min。上述各步间均用PBS缓冲液浸洗3次，每次5min。滴加新鲜配制的DAB，室温显色10min，蒸馏水洗。苏木素复染，水性封片剂封片，光学显微镜下观察。
2 结 果
2.1 形态学观察
松质骨BMG复合软骨细胞移植体内修复同种异体兔膝关节骨软骨缺损，术后6个月肉眼观察显示修复组织与周围正常软骨已愈合，修复组织表面基本平整，颜色与周围正常软骨组织近似(图1A)。HE染色显示修复交界区整合良好，不易辨认。修复组织为透明样软骨组织，深层细胞柱状排列，软骨细胞存在软骨陷窝内，重建了软骨下骨板(图1B)。基质染色显示修复组织基质蛋白聚糖(图1C)和胶原(图1D)表达接近周围正常软骨，分布均匀。
2.2 蛋白聚糖代谢改变
修复组织中下层3-B-3(-)表达阳性，细胞浆染成绿色，显示修复组织合成新的蛋白聚糖(图2A)。BC-13在修复组织和周围正常软骨染色都为阴性(图2C)。MMPs主要存在于修复组织的中下层，部分细胞质染成棕黄色(图2D)。MMPs裂解表位BC-4染色阳性，细胞质染成绿色，中下层染色重(图2F)。
