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1.2.2 MTT法测定PAMD和伊马替尼(IM,STI571)的细胞毒性[2] 取对数生长期的K562/S和K562/MDR1细胞,配制成1×105/ml单细胞悬液,接种于96孔培养板,每孔0.1 ml,实验组分为两组,一组加入PAMD至终浓度为40,20,10,5,2.5,1.25,0.625 mg/L,另一组加入STI571至终浓度为5,2.5,1.25,0.625,0.315 μmol/L,每个药物浓度设6个复孔,空白对照组不加药,置于37℃饱和湿度5% CO2条件下常规培养72 h,每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml),再置37 ℃、5% CO2培养箱内继续培养4 h。吸取上清液,每孔加入100 μl DMSO振荡5 min,用酶联仪在570 nm波长下测光密度,同时计算各组细胞的半数抑制浓度(IC50),按下列公式计算耐药细胞的耐药倍数。同时测定PAMD的IC10,选取低于IC10的药物浓度进行逆转研究[3]。
耐药倍数=耐药细胞的IC50/敏感细胞的IC50。
1.2.3 MTT法测定细胞的药敏性 取对数生长期的K562/MDR1细胞,配制成1×105/ml 单细胞悬液,接种于96孔培养板,每孔0.1 ml,各组加入STI571至终浓度为5,2.5,1.25,0.6,0.3 μmol/L,同时每组加入终浓度为0.625 mg/L的PAMD逆转剂,每个药物浓度设6个复孔。同“1.2.2”方法测定D/(570) nm,按STI571浓度抑制率曲线计算出IC50,求出逆转剂PAMD作用后的逆转倍数。
逆转倍数=耐药细胞逆转前的IC50/耐药细胞逆转后的IC50
1.2.4 流式细胞术(FCM)检测逆转后耐药细胞的凋亡百分率 取对数生长期的K562/MDR1细胞,调整细胞的初浓度,实验组分别加入STI571至终浓度为5,2.5,1.25,0.625,0.315 μmol/L,同时每组加入终浓度为0.625 mg/L逆转剂,阴性对照组加入等体积的RPMI1640培养基。置37℃、5%CO2培养箱培养72 h后收集细胞,AnnexinVFITC/PI双染后上流式细胞仪进行检测,每份标本设一个复管,重复1次,计算凋亡细胞百分数。
1.2.5 统计学处理 采用SPSS 13.0 软件包处理,数据以±s表示,t检验计算比较实验和对照各组的D值。采用线性回归计算IC50。
2 结 果
2.1 PAMD诱导后K562/S和K562/MDR1细胞凋亡百分率 AnnexinVFITC/PI双参数检测肿瘤细胞的凋亡情况,细胞凋亡流式散点图上可见实验组细胞凋亡明显高于对照组,低浓度的PAMD(0.625～10.0 mg/L)作用72 h凋亡细胞百分率呈剂量依赖性,Ⅳ象限细胞(FITC+,PI-)增加并随药物浓度递增比例提高,当剂量大于10 mg/L时,Ⅱ象限(PI+，FITC+)凋亡后坏死细胞和部分坏死细胞明显增多(图1)。凋亡率为Ⅳ象限细胞占全部细胞的百分率(表1)。表1 蝙蝠葛酚性碱诱导K562/MDR1和K562/S细胞凋亡率的影响
2.2 PAMD和STI571的细胞毒性及耐药细胞的耐药倍数 PAMD和STI571分别对K562/MDR1和K562/S细胞都存在显著的细胞毒性作用,且呈明显的量效关系。不同浓度的PAMD和STI571对亲本细胞和耐药细胞的抑制率曲线见图2,图3。通过回归方程计算PAMD对K562/MDR1和K562/S的IC50分别为11.57 mg/L和7.59 mg/L,两者比较差异无统计学意义(P>0.05),说明K562/MDR1细胞对PAMD没有耐药性。同时测得STI571对K562/MDR1和K562/S的IC50分别为8.27 μmol/L和1.83 μmol/L,即K562/MDR1细胞对STI571的耐药倍数为4.52倍。
2.3 细胞药敏性及对耐药细胞的逆转倍数
PAMD对K562/MDR1的IC10为0.632 mg/L,因此把低于IC10剂量(0.625 mg/L)的PAMD作为最佳逆转浓度。STI571单独作用于K562/MDR耐药细胞72 h的IC50为8.27 μmol/L,STI571与低于IC10剂量的PAMD共同作用72 h后,K562/MDR1耐药细胞的IC50降低为3.72 μmol/L,但仍远远高于对敏感细胞K562/S的值1.83 μmol/L,STI571对多耐药细胞K562/MDR逆转倍数为2.22倍(图4)医.学.全.在.线www.lindalemus.com。
2.4 逆转后耐药细胞K562/MDR1的凋亡率
各浓度的STI571与0.625 mg/L的PAMD联合应用作用于多药耐药K562/MDR1细胞72 h后,K562/MDR1未处理组自然凋亡率为(3.05±0.05)%,STI571的各浓度单独应用以及与0.625 mg/L的PAMD联合应用结果见表2。由此可见,当STI571与低于IC10剂量的PAMD联合应用时,可以显著提高K562/MDR1细胞的凋亡率(P<0.01)。表2 PAMD对逆转后耐药细胞K562/MDR1凋亡率的影响
3 讨 论
肿瘤多药耐药的实质是肿瘤细胞对治疗药物的防御与适应的一种反应。自从Biedle发现多药耐药现象以来,国内就对肿瘤细胞多药耐药的逆转进行热点研究。目前研究发现,药物分布及摄取、代谢与失活、药物作用效靶、DNA损伤与修复以及凋亡途径改变等多种机制参与多药耐药的形成,其中主要机制之一是细胞过量表达了一种P糖蛋白(Pglycoprotein,Pgp),它通过消耗ATP主动把细胞内化疗药物从细胞内快速“泵出”,使细胞内药物浓度下降,导致细胞内药物聚集减少,从而产生多药耐药性。在体外具有逆转肿瘤多药耐药作用的耐药调节剂主要包括:钙通道阻滞剂(异博定),钙调蛋白拮抗剂(三氟丙嗪),免疫调节剂(环孢素A),抗生素类(红霉素)以及干扰素(IFNα)等。尽管体外实验证明这些药物能够逆转肿瘤化疗药物的耐药,但它们在临床应用时多受到禁忌证多、不良反应大、药效不稳定、难以作用到靶点等因素的影响。如异博定、环孢素A等虽然已经进入临床试验阶段,但是它们明显的不良反应限制了临床应用,疗效也不是很理想[4]。因而迫切需要寻找其他治疗指数更大、确有临床价值的化疗增敏剂。
研究证实,钙拮抗剂通过破坏Pgp的功能,竞争性抑制Pgp的外排而逆转多药耐药,从而达到增强化疗效果的目的[5]。研究发现,钙通道阻滞剂异喹啉类生物碱具有一定的逆转肿瘤细胞耐药的作用。田晖等[6]研究发现双苄基异喹啉生物碱——蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对天然耐药的BEL7402细胞和获得性耐药的MCF7/Adr、KBV200细胞均有明显逆转多药耐药作用。田春艳等[7]在对从中药功劳木的根中提取的一种异喹啉类生物碱研究发现,它能增加多柔比星对K562/ADM的细胞毒作用,提高其对耐药细胞K562/ADM的杀伤性,部分逆转了K562/ADM细胞的耐药。
