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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 病毒 CVB3m由哈尔滨医科大学微生物学教研室惠赠。
1.1.2 质粒、细胞与实验动物 pNI4质粒含CVB1 cDNA全序列[3]，由日本东京大学Narushi Iizuka教授惠赠;HeLa细胞和工程菌株E. coli DH5α均购自哈尔滨医科大学微生物学教研室;Balb/c乳鼠(出生4天内)购自徐州医学院实验动物中心。
1.1.3 主要酶类及试剂盒 质粒小量提取试剂盒W5001及DNA小量胶回收试剂盒W5211购自上海华舜生物工程公司。真核转染试剂Tfx-50为Promega公司产品。RNA提取试剂盒TRIzol Reagent为Invitrogen公司产品。Thermo ScriptTM RT-PCR试剂为Invitrogen公司产品。限制性核酸内切酶EcoR V、ClaI、PstI、碱性磷酸酶CIAP及Wide rang DNA ladder marker均为Takara公司产品。
1.1.4 主要试剂 DMEM/F12培养基(GIBCO公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶(GIBCO公司)，胶原酶Ⅱ(Sigma公司)，兔抗小鼠肌动蛋白(actin)抗体(Santa Cruz公司)，羊抗兔IgG-TRITC(北京中杉金桥生物技术公司)，5′-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU，Sigma公司)，其余试剂均为国产分析纯。
1.1.5 细胞培养液 DMEM/F12，pH 7.2～7.4，使用时加入15%胎牛血清，1%双抗。消化液为0.2%胰蛋白酶和0.1%胶原酶Ⅱ混合液(1∶1)。BrdU用去离子水配制，加入到15%DMEM/F12培养液中，终浓度为0.1 mmol/L，可以抑制非心肌细胞的生长。
1.1.6 50×TAE电泳缓冲液 Tris碱242 g、冰乙酸57.1 ml、0.5 mol/L pH 8.0的EDTA 100 ml溶于终体积1 000 ml 去离子水中，使用时1∶50倍稀释;10×加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青、30%甘油混匀后保存于4℃;10 g/L溴化乙锭(EB)溶液：0.2 g EB溶于20 ml去离子水中，混匀后4℃避光保存，使用时终浓度为0.5 g/L;0.7%和1%琼脂糖凝胶：0.7%和1%琼脂糖分别溶于1×TAE中。
1.2 方法
1.2.1 乳鼠心肌的取材 取出生1～4天内的Balb/c乳鼠，75%乙醇消毒皮肤，无菌条件下从胸腔取出心脏，取出的心脏立即放入装有预热37℃的D-Hanks液的培养皿中，可见到心脏仍然保持搏动。
1.2.2 乳鼠心肌细胞的分离和培养 取出的心脏在加有37℃的D-Hanks液的平皿中，洗1～2次，置于无血清无双抗的DMEM/F12中，并在其中把心脏剪成体积为1 mm3的小块;事先准备好2支离心管， 第1支加入5 ml左右15%DMEM/F12培养液(含血清和双抗)，第2支空，其中第1支放入4℃冰箱中备用。将小块的心肌放入第2支空着的离心管中，并加入1.5 ml消化液，然后放入到事先准备好的37℃的水浴锅中消化，每次消化11 min，弃上清(保持温度在37℃)，重复3次;第4次加入消化液2 ml，消化20 min，每隔5 min摇匀，每隔10 min吹吸，以加速心肌细胞的消化，20 min后将消化液吸出，放入在4℃冰箱中的离心管中，重复3次。将收集好的心肌细胞1 500 r/min离心7 min，弃上清，用5 ml预热37℃ 的15%DMEM/F12培养液重悬;在无菌平皿中用滤网过滤细胞悬液以去除大块有形成分;将过滤好的细胞液收集到培养瓶中，置于37℃ 5% CO2孵箱中培养2 h，吸出尚未贴壁的细胞悬液，转移到24孔培养板中，置于37℃ 5% CO2孵箱中培养， 48 h后换液，以后每3～4天更换培养液1次。定期在倒置显微镜下观察细胞生长的情况并摄影记录。
1.2.3 心肌细胞的鉴定 ①倒置显微镜下常规观察细胞的生长情况，并可见心肌细胞的搏动;②超微结构观察：培养的细胞用消化液消化后，1 500 r/min离心、收集心肌细胞，戊二醛固定，送电镜中心，透射电镜观察并摄片。
1.2.4 pNI4质粒转染心肌细胞 在转染前把心肌细胞的培养液换成无双抗培养液培养，当心肌细胞90%成层分布后开始转染，按照转染试剂盒的说明进行。每天倒置显微镜下观察心肌细胞的变化，并在转染后的第1、3、6天吸取心肌细胞的上清液冻存，测定心肌酶。
1.2.5 嗜心肌毒株CVB3m攻击心肌细胞 培养的心肌细胞90%成层分布后进行病毒接种。方法如下：弃上清，每孔加入稀释好的病毒100 μl，37℃ 5% CO2孵箱中孵育1 h，加入细胞培养液至1 ml，37℃ 5% CO2孵箱中培养。每天在倒置显微镜下观察心肌细胞的变化，并在不同的时间段吸取细胞上清液，测定心肌酶谱和提取病毒RNA，最后用消化液消化、1 500 r/min离心、收集心肌细胞，戊二醛固定，超薄切片，透射电镜观察心肌细胞的超微结构医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
2 结 果
2.1 心肌细胞形态观察 倒置显微镜下，消化后的心肌细胞呈圆形，细胞数为4.8×109/L，2 h后开始贴壁生长，心肌细胞伸展为圆形、梭形、棒状、星状及分叉状等，1～2个呈圆形的胞核，核仁清晰可见，可见心肌细胞搏动，频率为20～30次/min，搏动细胞达70%，搏动频率有所不同;24 h后95%的细胞均有搏动，当生长成片后可见岛屿状搏动，搏动频率为80～150次/min(图1A);超微结构观察显示，培养的心肌细胞肌丝发达，游离的核糖体、糖原及线粒体丰富，肌节明显，粗肌丝与细肌丝相间排列形成明显的Z 线。相邻心肌细胞之间伸出许多突起，由中间连接、桥粒及缝隙连接构成闰盘结构。线粒体多分布于核周或排列在肌丝之间，嵴呈板状， 与线粒体长轴垂直或平行，密集排列。心肌细胞核为1～ 2个，椭圆形，核仁清晰，染色质分布均匀(图1B)。图1 原代培养Balb/c乳鼠心肌细胞形态观察
