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A.倒置显微镜下观察(×100);B.心肌细胞超微结构观察(×20 000)
2.2 心肌细胞成活率的测定 取细胞悬液，稀释到109/L，用0.4%台盼蓝染色，未着色的为活细胞,呈蓝色的为死细胞,显微镜下观察并计算心肌细胞的成活率，计数200个细胞，11个染蓝色，成活率为94.5%。
2.3 pNI4质粒转染心肌细胞后倒置显微镜观察结果 质粒转染前的心肌细胞在倒置显微镜下可见：心肌细胞伸展为圆形、梭形、棒状、星状及分叉状等;胞核多为1个，间或多个，核呈圆形，核仁清晰;可见到自发性搏动，但节律不一，慢的1 min仅数次，快的可达120次/min以上;细胞间形成细胞簇，可出现同簇细胞的同步搏动(图2A)。质粒转染后第3天，心肌细胞数量减少，心肌细胞主要为梭形和分叉状;胞核为1～2个，核呈圆形，但是核仁不清晰;仍然可以见到自发性搏动，但是节律不齐;可见到心肌细胞呈空泡样改变，很难看见成簇的心肌细胞(图2B)。图2 pNI4转染前后的心肌细胞形态比较(×400)
A.转染前;B.转染后
2.4 CVB3m攻击后心肌细胞形态观察结果 CVB3m病毒攻击后3天左右，倒置显微镜下可见成纤维细胞破裂崩解，细胞核固缩，飘浮在培养液中。心肌细胞没有出现明显的细胞病变(CPE)，仍然搏动但是较慢、不规则，心肌细胞仍然贴壁生长(图3);超微结构观察可见心肌细胞呈矩形，核位于质膜下，核周细胞器丰富，核膜增厚，细胞核形状可见畸变，核内染色质明显固缩，细胞膜和肌原纤维基本完整，但是线粒体膜部分破裂，线粒体嵴呈絮状改变或者肿胀而大小不一，胞质内可见到结晶状的病毒颗粒，呈黑色点状排列(图4)。图3 CVB3m感染的心肌细胞形态学观察(×100)
2.5 pNI4质粒转染心肌细胞后心肌酶检测结果 分别在转染前(1、3天)和转染后(1、3、6天)吸取细胞上清液，冻存后使用日立7600型生化自动分析仪来测定心肌细胞酶。结果显示质粒转染后，病毒在心肌细胞中合成复制，导致心肌细胞部分破裂崩解，致使心肌酶都有不同程度的升高(表1);经过3天以后，心肌酶开始下降，有的降到了非常低的水平，此时的心肌细胞仍然存活并可见搏动。
2.6 CVB3m病毒攻击后心肌酶检测结果 病毒接种后留1孔做空白对照，比较加病毒后心肌酶的变化。结果可见，病毒感染心肌细胞后，虽然没有出现明显的细胞病变，但是在病毒感染的情况下心肌酶的释放会升高(表2)。表1 pNI4质粒转染后心肌酶测定结果(2批心肌细胞测定后取平均值)表2 病毒接种后心肌细胞酶测定(2批心肌细胞测定后取平均值)
2.7 RT-PCR扩增CVB3病毒5′-UTR的结果 为了证明心肌细胞中有CVB3存在，并且病毒处于持续感染状态，吸取质粒转染后和病毒感染后的心肌细胞的上清液，应用逆转录PCR扩增病毒的5′-UTR(Mastercycler gradient PCR)，结果如图5所示，扩增到特异性大小的目的片断，均为750 bp。
图5 RT-PCR扩增CVB3病毒5′-UTR
1.CVB3m阳性对照;2.pNI4质粒转染后心肌细胞的上清液;3.CVB3m感染心肌细胞后的病毒上清液;4.阴性对照;M.DL 2 000 Marker
3 讨 论
3.1 心肌细胞的原代培养 自1960 年Harary首次对Wistar 乳鼠的心肌细胞进行培养，并成功维持自发性搏动长达40天以来，国内外诸多学者开展了离体心肌细胞的生长发育、生理、代谢、病理、药理等方面的研究。本实验的方法在前人方法的基础上加以改进，体外分离和培养Balb/c乳鼠心肌细胞，并成功地获得了很高的成活率和纯度!
培养24 h后存活的心肌细胞即可贴壁生长，而破坏严重的心肌细胞难于贴壁而悬浮于培养液中并逐渐肿胀、破裂而死，此时更换培养液可进一步提高心肌细胞的存活率;利用actin免疫荧光检测，证明我们获得的Balb/c乳鼠原代心肌细胞纯度达95%;心肌细胞搏动表明具有自律性的心肌细胞活性和状态良好。
通过反复实验我们发现：①最好选择1～4天内的新生鼠进行原代心肌细胞培养，尤其是3天内培养更好;②严格无菌操作，打开胸腔后迅速摘取跳动的心脏，操作要熟练快捷;③利用BrdU对成纤维细胞的抑制作用，以及差速贴壁等方法，可以极大地纯化心肌细胞;④消化过程是影响心肌细胞存活率的重要因素，胰蛋白酶可分解组织间质的蛋白成分,但对肌细胞膜蛋白亦起较强的破坏作用[4]，故对其作用时间和浓度的要求较为严格。而每次实验都可能有细微差别，所以应结合肉眼观察消化情况及时终止消化，不宜固定精确的消化时间。胶原酶可消化细胞间质的胶原纤维以释放细胞，作用较缓和，对细胞损伤较小;经过多次重复实验，我们认为单一使用胰蛋白酶消化对细胞损伤大，联合使用胶原酶将胶原纤维充分消化后利于离心时细胞沉淀,提高心肌细胞存活率，细胞贴壁早，搏动出现亦早[5]。第1次消化时间不宜过长，否则会丢弃一些已消化下来的心肌细胞。终止消化后的消化产物应立即离心，而后用培养液重悬以使受损的细胞尽早恢复。消化过程中反复吹打使酶与组织充分均匀接触，使心肌细胞呈单个分散状态从而减少消化次数和时间，提高细胞存活率。吹打不充分细胞团块占5% 以上会大大降低心肌细胞的收获率，并且从团块中爬出来的成纤维细胞影响心肌细胞的生长和纯度[6]。⑤培养液是维持细胞生存的基本条件，心肌细胞在偏酸性环境中(pH值7.0～7.2) 更利于生长，培养液储存后pH值逐渐升高，最好现配现用。抗生素的药效浓度与毒效浓度接近，对细胞可造成损害，实验中注意无菌操作可有效预防污染，故培养液尽量少加抗生素[7]医.学全.在.线网站www.lindalemus.com。
