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1 材料和方法
1.1 材料
30只健康成年豚鼠(体质量300～400g，雌雄不拘)由本校实验动物中心提供.50g L-1 心得安乳剂由西京医院药剂科配制.自行设计角蛋白K14，16，17探针，由北京奥科公司合成，原位杂交试剂盒购自博士德公司.
1.2 方法
①模型制备:实验动物随机分为两组，实验组20只，应用50g L-1 心得安乳剂均匀外涂双耳背皮肤，每日3次，连续涂4wk.对照组10只用单纯乳剂涂抹.4wk后取双耳背部皮肤，一只耳用100mL L-1 甲醛溶液固定，另一只耳置于干燥瓶中，存放于-80℃低温冰箱保存.②HE染色:将用100mL L-1 甲醛溶液固定的标本脱水，透明浸蜡后包埋，制作石蜡切片，常规HE染色.在光镜下逐一观察组织学所见.③原位杂交:置于干燥瓶中的组织经常规脱水、浸蜡包埋后切片，厚度6μm，展开在经多聚赖氨酸处理的载玻片上，切片经常规脱蜡脱水，30mL L-1 H 2 O2 室温处理10min以灭活内源性过氧化物酶，PBS洗5min×3次.滴加胃蛋白酶工作液，37℃消化10min，充分暴露mRNA，0.5mol L-1 PBS洗5min×3次，蒸馏水洗1次.每张切片上加20μL含标记探针的原位杂交液，盖上专用盖玻片，置湿盒中37℃杂交过夜.同时设不加探针的空白对照.分别用30℃的2×SSC和0.2×SSC各洗涤5min×3次.滴加封闭液，室温20min.滴加兔抗地高辛，37℃孵育1h，0.5mol L-1 PBS洗2min×3次.滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育30min，0.5mol L-1 PBS洗2min×3次.滴加SABC，7℃孵育30min，0.5mol L-1 PBS洗5min×4次.DAB显色，苏木素复染，充分水洗，然后乙醇脱水，二甲苯透明，封片医.学.全.在.线www.lindalemus.com.
2 结果
2.1 HE染色结果
正常对照组豚鼠皮肤可见菲薄的角质层，颗粒层约为1～3层，棘细胞层约3～5层，基底层为单层柱状细胞.真表皮交界较平，真皮内有散在少数单核细胞浸润(Fig1).实验组全部标本共40份均可见到不同程度的棘层肥厚、表皮突延伸呈棒状、真皮乳头上伸杵状变及毛细血管扩张，36份标本可见广泛或局灶性的角化不全，颗粒层变薄或消失(Fig2).我们参考通用的Baker评分方法，对每份标本逐一进行组织学评分分析.应用组织评分法(典型的银屑病皮损评分在4.0～10.0之间)评分得到，40份涂药组标本组织学评分为7.6±0.6，20份正常对照组组织学评分为0.8±0.1，经统计学处理结果差异显著(P<0.01).
2.2 原位杂交结果
对正常豚鼠耳背部皮肤和银屑病动物模型皮损处组织的K14，16，17原位杂交结果显示，正常皮肤中，在基底层细胞中见到K14的阳性杂交信号，表现为细胞浆中出现棕黄色细小或粗大颗粒，但信号较弱，而K16和K17则未见到阳性信号.在银屑病样皮损中，基底层及棘细胞层均有K14的高表达，在棘细胞层K16高表达;而K17仅为低表达(Fig3～6).根据图象扫描后的处理结果显示，银屑病模型动物皮损处角蛋白K14及K16的表达较对照组显著升高(K14P<0.05，K16P<0.01)，而K17的表达则无显著性差异.
图1 正常对照组HE染色(略)
Fig1 HE staining of normal control group ×200
图2 实验组HE染色(略)
Fig2 HE staining of treated group ×200
图3 正常对照组角蛋白K14原位杂交(略)
Fig3 Keratin14hybridization in situ of normal control group ×200
图4 实验组角蛋白K14原位杂交(略)
Fig4 Keratin14hybridization in situ of treated group ×200
图5 正常对照组角蛋白K16原位杂交(略)
