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1.10 RTPCR检测 用TRIZOL试剂盒提取牙周膜细胞总RNA，取2.5μg总RNA用逆转录试剂盒进行转录。OPG分子引物序列：上游引物5′TCAAGCAGGAGTGCAATCG3′，下游引物5′AGAATGCCTCCTCACACAGG3′，该引物将产生342bp的cDNA片段。RANKL分子引物序列：上游引物5′GGCTCATGGTTAGATCTGGC3′，下游引物5′TGACCAATACTTGGTGCTTCC3′，该引物将产生351bp的cDNA片段。βactin分子引物序列：上游引物5′CAATTCATGTTTGAGACCTTCAA3′，下游引物5′CCGGATCCATCTCTTCCTGGAAGTCCA3′，该引物将产生362bp的cDNA片段。上述引物序列由由上海Sangon公司合成。取PCR反应产物15μL在15g/L琼脂糖凝胶上电泳，置于凝胶电泳成像仪，利用凝胶系统分析软件Bandscan 5.0进行半定量分析。
1.11 统计学处理 所有数据均以均数±标准差表示，采用SPSS10.0统计学软件进行方差分析，显著性水准a=0.05。
2 结 果
2.1 重组质粒的鉴定 质粒转化后，从平皿上挑取3个单克隆菌落提取质粒，酶切鉴定后10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，重组质粒和对照质粒泳动速度相同，初步表明质粒重组成功。将鉴定正确的质粒进行DNA序列鉴定，结果与设计的目标序列完全一致，表明已成功构建了TGFβⅡR siRNA表达载体。
2.2 潮霉素筛选浓度的确定和转染细胞的筛选 经不同浓度的潮霉素筛选后，T细胞在含 100mL/L FBS、200mg/L G418和200mg/L潮霉素的DMEM培养基中培养到第8天时全部死亡;其他条件保持不变，仅潮霉素为150mg/L时培养到第10天时细胞仍有部分存活。因此，选择200mg/L潮霉素为转染后T细胞的筛选浓度。
2.3 siRNA转染对T细胞生长的影响 分别转染siRNA1和siRNA2的T细胞生长速度与对照组正常T细胞的生长速度相似(图1)，各组间差别无统计学意义(P>0.05)医.学.全.在.线www.lindalemus.com。
图1 T细胞的生长曲线
Fig.1 Growth curve of T cells
2.4 siRNA转染的T细胞中TGFβⅡR的表达 RTPCR(图2A)和Western blot(图2B)结果均显示，转染siRNA1的T细胞组的TGFβⅡR 产物的条带明显暗于对照条带，转染siRNA2的T细胞组的TGFβⅡR表达产物与对照组细胞相比无明显变化。提示转染siRNA1的T细胞组的TGFβⅡR mRNA的表达被明显抑制。表明siRNA1对T细胞中TGFβⅡR mRNA的降解作用是高效的、特异的。
2.5 各组OPG和RANKL在牙周膜细胞上的表达 经RTPCR检测，各组OPG和RANKL在牙周膜细胞上的表达各不相同(图3)。
2.6 各组RANKL/OPG比值的比较 以组别为x轴，以RANKL与OPG的比值为y轴，建立图4。结果显示，RANKL/OPG比值在各实验组中由大到小依次为：实验组④>②>①>③>⑥>⑤，组间比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
3 讨 论
本实验采用Ambion公司开发的哺乳动物细胞表达载体pSilencer RNA系统，将编码针对TGFβⅡR siRNA的DNA模板定向克隆，使插入序列能被有效转录，从而形成内源性表达的RNA。RNA正向链的3端Psilencer载体稳定表达的siRNA可持续、高效、特异性地抑制目的基因的表达。
TGFβ受体目前共发现8种，研究比较清楚的是受体I、受体Ⅱ和受体Ⅲ。这3种受体具有较高的同源性，其中受体I和受体Ⅱ参与TGFβ的信号传导，而受体Ⅲ与信号传导无关[9]。TGFβ与细胞膜表面的Ⅱ型受体形成复合物，经活化才能产生信号转导作用。在此过程中Ⅱ型受体胞质区的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域可将Ⅰ型受体胞浆区GS结构域的丝氨酸/苏氨酸磷酸化，继而Ⅰ型受体磷酸化。活化后的Ⅰ型受体进一步作用于细胞内的下游分子，使TGFβ的信号细胞内转导。Ⅱ型TGFβ受体的基因中含有一段10bp的多聚A重复序列，该序列增加或丢失碱基都将导致Ⅱ型TGFβ受体变构而失活,从而使TGFβ不能与受体正确的结合并发挥生物学作用。由此可见，TGFβⅡR在TGFβ的信号传导过程中起着不可替代的关键作用。因此，本实验选择TGFβⅡR作为基因沉默的靶点，能够准确地阻断TGFβ的信号传导。
本实验首先构建两个靶向TGFβⅡR的siRNA真核表达载体，并将其中之一的siRNA1成功转染了正常人外周血T细胞，使T细胞表面的TGFβⅡR基因沉默，TGFβ的信号传导过程被阻断，从而使T细胞活性增高。siRNA2载体未能成功转染T细胞的原因，考虑与转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间)未达到最佳优化有关。
