医学免费论文:细胞间黏附分子1在红霉素抗炎机制中的作用

来源：本站原创更新：2013-10-15 论文投稿平台

1.2 细胞培养人支气管上皮细胞(16HBE)(美国加州大学)由中南大学湘雅医学院细胞中心提供，含10%胎牛血清的DMEM培养体系6～10 ml，细胞密度1～2×106/ml接种于50 ml培养瓶，于37℃，5%CO2培养箱中培养。细胞长满70%～80%时随机分为8组：①空白对照组，②TNFα(20 ng/ml，16 h)组，③EM(0.3 μg/ml，24 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组，④EM(3 μg/ml，24 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组，⑤EM(30 μg/ml，24 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组，⑥EM(0.3 μg/ml，48 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组，⑦EM(3 μg/ml，48 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组，⑧EM(30 μg/ml，48 h)+TNFα(20 ng/ml，16 h)组医.学.全.在.线www.lindalemus.com。

1.3 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)

1.3.1 提取细胞总RNA(按Trizol说明书) 取1 ml内含1×106个细胞的培养液于1.5 ml Eppendorf离心管中，4℃，2 000 r/min离心5 min，弃上清液。加入1 ml Trizol分离试剂，用移液器吸头吸打重悬细胞沉淀，室温孵育5 min。加入0.2 ml氯仿，振摇15 s，室温孵育10 min。4℃，13 000 r/min离心15 min，收集上层无色水相于1.5 ml Eppendorf管中，弃沉淀管。加入0.5 ml异丙醇，振荡混匀，室温孵育5 min。4℃，13 000 r/min离心10 min，弃上清液。加入1 ml 75%乙醇并震荡。4℃，13 000 r/min离心10 min，弃上清液。真空干燥离心机干燥5 min。加入8 μl DEPC处理水溶解RNA。取2 μl电泳分析RNA质量。

1.3.2 逆转录反应各组提取的总RNA重悬于6 μl DEPC水中，加入8 U RNasin，Oligod T15(500 ng/μl)，ICAM1下游引物50 pmol，混匀，13 000 r/min离心30 s，70℃水浴5 min，然后立即置冰上冰浴(退火)。20 μl RT反应体系中含5×RT缓冲液4 μl，12 U RNasin，4μl 2.5 mmol/L dNTPs，5 U AMV逆转录酶，然后用DEPC处理水补足终体积至25 μl，轻敲混匀，稍离心，42℃水浴1.5 h后，于-20℃保存。

1.3.3 聚合酶链反应(PCR) 取逆转录产物为模板，扩增βactin、ICAM1基因。ICAM1，βactin PCR反应条件：取RT反应产物2 μl为模板，加入10×PCR buffer 2μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，25 mmol/L MgCl2 1.5 μl，ICAM1上游引物0.5 μl(10 pmol/μl)，βactin上、下游引物各0.5 μl(10 pmol/μl)，补充消毒双蒸馏水9 μl，再加入5 U/μl TaqE 1 μl，加入约25 μl左右的矿物油盖于液面上。扩增参数为94℃，30 s，57℃，30 s，72℃，30 s，循环30次，然后72℃延伸10 min，停止，4℃保存。ICAM1扩增片段长度为490 bp，βactin扩增片段长度为260 bp。

1.3.4 cDNAPCR产物电泳和照相分析取PCR产物5 μl，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，以Generuler 100 bp DNA Ladder Marker为分子量标准，英国GENEGENIUS快速成像系统摄影，图片经英国GENEGENIUS图像分析处理系统分析，对扩增产物条带进行扫描，记录光密度值，以ICAM1/βactin的比值作为ICAM1 mRNA表达的相对含量。

1.4 克隆测序回收ICAM1扩增产物(PCR产物)，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收扩增目的片段;按产品说明书要求进行PCR产物与T载体连接反应，CaCl2法制备大肠杆菌DH5α新鲜感受态细胞100 μl，然后加入连接反应产物进行转化，转化产物均匀涂布于氨苄青霉素阳性(100 μg/ml)LB固体培基平板上，37℃倒置平板过夜培养;第二天挑取培养板上数个单克隆菌落，接种至氨苄青霉素阳性(100 μg/ml)LB液体培基(10 ml)，37℃，220 r/min，空气摇床上振荡培养过夜。取菌液1 μl为模板在50 μl体系中进行PCR扩增鉴定，随机挑选获阳性扩增结果者送样至上海博亚生物技术公司进行序列分析。

2 结果

2.1 RTPCR结果 TNFα刺激16HBE16 h后，与空白对照组比较，ICAM1 RTPCR产物表达明显增高;先予不同浓度的EM作用于16HBE 24 h或48 h后，再用TNFα刺激16 h，与仅用TNFα刺激组比较，各组16HBE ICAM1 RTPCR产物表达均降低，且提示有浓度和时间依赖性。见图1，表1。

1.Marker;2.对照组;3.TNFα(20 ng/ml16 h)刺激组;4.EM(0.3 μg/ml24 h)+TNFα(20 ng/ml16 h);5.EM(3 μg/ml24 h)+TNFα(20 ng/ml16 h);6.EM(30 μg/ml24 h)+TNFα(20 ng/ml16 h);7.EM(0.3 μg/ml48 h)+TNFα(20 ng/ml16 h);8.EM(3 μg/ml48 h)+TNFα(20 ng/ml16 h);9.EM(30 μg/ml48 h)+TNFα(20 ng/ml16 h)

2.2 RTPCR和克隆测序结果 ICAM1 RTPCR产物分子大小约为700 bp，与原设计产物分子大小490 bp不相符，进一步作克隆测序了解基因之间是否具有同源性。将ICAM1 PCR产物DNA序列与ICAM1基因进行blast比较，具有高度同源性，显示PCR产物即为目的基因：ICAM1基因。见图2。　表1 EM对ICAM1 mRNA表达的影响

3 讨论

细胞间黏附分子1(ICAM1)是细胞表面黏附分子，属免疫球蛋白超家族，能与白细胞功能相关抗原1(LFA1)即(CD11a/CD18)结合发挥作用。主要分布在各种上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、单核巨噬细胞和淋巴细胞等，ICAM1的生物学功能包括细胞黏附，细胞分化发育，参与抗原呈递和T细胞活化，细胞介导的细胞毒作用，炎症等多方面。本实验结果发现，提取16HBE细胞ICAM1mRNA进行RTPCR，RTPCR产物DNA序列与ICAM1基因具有高度同源性，显示PCR产物即为目的基因：ICAM1基因。但两者之间存在差异，本实验提示，不同种族、不同组织细胞ICAM1基因表达可能具有一定差异性。

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