医学免费论文:NFκB及其相关炎性因子致大鼠移植肝冷保存损伤的机制

来源：本站原创更新：2013-10-15 论文投稿平台

凝胶电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assays, EMSA)按YANG等[8]的方法提取肝组织的核蛋白，-70℃冻存备用，用考马斯亮蓝蛋白浓度检测试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)测定蛋白浓度。结合NFκB的寡核苷酸探针(上海生工生物工程技术有限公司合成)双链核苷酸序列为5′AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C3′，3′TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G5′，以γ32PATP(北京福瑞生物工程公司产品)进行探针标记。室温下将2μL 5×凝胶滞留结合缓冲液、核蛋白10μg、鲑精DNA(4g/L)1μL混匀，10min后加入γ32PATP标记的NFκB探针2μL，反应30min后加入5×上样缓冲液2μL，60g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳2h(110V)后，-70℃放射自显影6h。X光片置于BIORAD凝胶图象分析系统测定NFκB活性值(A值)来表示提取物中NFκB的DNA结合活性。NFκB活性值(A)=滞后带吸光度值(A)×滞后带面积值(S)。

1.3.2 冷保存期肝组织TNFα和IL1β的测定

采用免疫组化SABC法在石蜡切片上测定TNFα和IL1β的表达。TNFα和IL1β主要定位于细胞质内，表现为胞质黄染或棕黄色颗粒。免疫组化染色结果判定参照MATTERN的方法[9]。阳性染色深度：未见染色为0，轻度染色(染成浅黄色)为1，中度染色(染成棕黄色)为2，深度染色(染成棕褐色)为3;阳性细胞百分比：未见染色为0，染色细胞<25%为1，25%～50%为2，>50%为3。将这两方面得分相加，得分0～2分判为阴性表达，>2分(3～6)判为阳性表达。每组10例标本，每例标本随机选择10个高倍视野，记数100个细胞判定此例标本的表达为阳性或阴性，并计算阳性表达率。

1.3.3 TUNEL法检测肝细胞凋亡

肝组织石蜡切片厚4μm，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测。按DeadEndTM TUNEL检测试剂盒(Promage, USA)操作说明进行操作。阳性细胞表现为细胞核呈棕黄色着色。每张切片光镜(20×15)观察10×500个细胞，计算每100个细胞中平均阳性细胞数，即凋亡指数(apoptosis index, AI)。

1.3.4 再灌注后血清TNFα、IL1β的测定

血清TNFα、IL1β采用双抗体夹心ELISA法，试剂盒购自晶美生物工程公司，采用德国FLUO star OPTIMA高通量微板测试系统测定。

1.3.5 再灌注后血清ALT、AST的检测

采用日立生化分析仪7160，进行血清ALT、AST的检测。

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0软件，实验数据以均数±标准差(±s)表示。各组样本间均数用单因素方差分析比较，各组间阳性率用四格表的确切概率法比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肝移植模型的制备情况

正式实验共进行大鼠肝移植手术30例，手术死亡3例，成功率90%。供体手术(18.6±5.2)min，供肝修整(8.5±3)min;受体手术(30.2±6.4)min，无肝期(15.5±3.3)min。门静脉开放后，肝脏颜色迅速变红，并可以看到少量金黄色胆汁分泌。3h时存活受体大鼠可自行活动、饮水，满足获取标本需要。

2.2 肝组织冷缺血期和再灌注期NFκB的测定结果

NFκB在B组和C组冷保存期均呈现不同程度活化，组间比较无统计学差异(P>0.05)。D组同其他冷保存组相比，NFκB活性显著增高(P<0.05)。再灌注后，B组、C组和D组NFκB活性均较假手术组活性水平增高(P<0.05)。随着冷保存时间的延长，NFκB活性增高(P<0.05，表1、图1)。表1 不同冷保存时间组移植肝NFκB的活性(略)

2.3 冷保存期肝组织TNFα、IL1β的测定结果

随着冷保存时间的延长，TNFα和IL1β在肝组织中的阳性表达率逐渐升高，D组TNFα和IL1β的阳性表达率较A、B、C组明显升高(P<0.05，表2)。表2 不同冷保存时间肝组织TNFα及IL1β的表达(略)

2.4 再灌注期血清TNFα、IL1β及ALT、AST的测定结果医.学.全.在.线www.lindalemus.com

再灌注后，B、C、D组TNFα和IL1β均较假手术组明显升高(P<0.05)，而且随着冷保存时间延长，两种细胞因子活性均升高(P<0.05)。随着冷保存时间的延长，再灌注后血清转氨酶水平升高，组间比较差异有统计学意义(P<0.05，表3)。表3 再灌注后血清TNFα、IL1β、ALT、AST水平和细胞凋亡指数(AI)的变化(略)

2.5 再灌注后肝细胞的凋亡情况

凋亡细胞在TUNEL染色中显示为棕色或褐色小点。A组为正常肝组织，凋亡细胞罕见;随着冷保存时间的延长，移植肝再灌注后凋亡细胞在B、C、D组中表达逐渐增多，在中央静脉周围分布较多。经统计后得出：随着冷保存时间的延长AI值逐渐升高，B、C 、D组AI值均较A组明显升高(P<0.05)，而且组间比较差异有统计学意义(P<0.05，表3、图2)。

3 讨论

NFκB是一类能与多种基因的启动子或增强子κB位点发生特异性结合并启动基因转录的蛋白质。胞质中的NFκB/IκB三聚体，可被TNFα、IL1β、活性氧等多种细胞外刺激信号激活，继而NFκB活化入核，与靶基因特异性序列结合并启动转录。转录产物包括黏附分子、趋化因子和细胞因子(TNFα、IL1β)等，这些炎性介质参与P/RI的病理过程[10]。

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