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1.2 仪器与方法
1.2.1 仪器与试剂： Master Cycler PCR扩增仪(Eppendorf，德国);Gel Doc2000凝胶图像分析系统(BIO-RAD，美国)。限制性内切酶Mse I(BioLabs. Inc.New England);Taq DNA酶和全血DNA提取试剂盒均为大连TaKaRa公司生产。
1.2.2 外周血白细胞基因组DNA提取：4ml EDTA-Na2抗凝冰冻全血，按试剂盒说明分离提取其外周血白细胞基因组DNA，TE溶解后于-20℃保存。
1.2.3 PCR 扩增： CTLA-4(318)C/T位点引物设计据文献[2]，P1：5′GAAGGAT GGT GCTTCACAT 3′;P2： 5′ CTTTGCAGAAGACAGGGATGA 3′。引物由上海生工公司合成。PCR 扩增反应体系：DNA模板2μl，10×Buffer 5μl，25mmol/L MgCl2 3μl，dNTP 4μl，引物(终浓度20μM)各0.5μl，Taq DNA酶2.0 U，加ddH2O至50μl。反应条件为95℃预变性5min后再进入循环，95℃变性20s，56 ℃退火30s,72 ℃延伸30s，共35个循环。末次循环后72 ℃延伸5 min。PCR 产物以1.5 %琼脂糖凝胶100V电泳分离。
1.2.4 RFLP分析： 启动子C/T多态性分析,反应体系20μl，Mse I 1μl，10×NEB4缓冲液2μl，BSA 0.2μl，PCR 产物10μl，37 ℃温浴过夜。产物于2%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，扫描成像同时进行基因型鉴定。
1.3 统计学方法：采用SPSS 11.5软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间基因型频率、等位基因频率的比较用行×列χ2检验，显著性检验水平为P<0.05。
2 结果
2.1 酶切结果：含SNP-318(C/T)位点的PCR扩增片段长度为247bp，经MseΙ消化后基因型CC产生226bp和21bp两种片段;基因型CT产生226bp、130bp、96bp、21bp4种片段;基因型TT产生130bp、96bp、21bp 3种片段。其中21bp片段小,难以分辨，见图1(目录后)。
2.2 各组CTLA-4(318)基因型及等位基因频率比较：61例GD患者和79例正常对照(NC) 启动子基因型及等位基因频率见表1。对两群体基因型进行遗传平衡的χ2检验(GD组χ2=0.05，P=0.82;对照组χ2=0.04，P=0.84)，基因型频率分布均具有群体代表性。 GD患者CTLA-4基因启动子318C/T位点基因型与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，同样等位基因频率亦无统计学意义，见表1。表1 GD患者和正常对照CTLA4基因SNP-318C/T位点基因型及等位基因频率的比较注：GD组和对照组基因型比较，^χ2=1.80， P=0.18;等位基因频率比较^^χ2=1.04，P=0.31
3 讨论
CTLA-4位于人类染色体2q33，与CD28一样，是一种细胞跨膜分子，参与T细胞的调节。T细胞的应答、活化至少需要两种信号。其中第2信号即“共刺激信号”，由T细胞表面的CD28和APC表面的B7分子相互作用提供。CTLA-4与CD28竞争B7配体，向T细胞传递负性信号，对T细胞增殖具抑制性调节作用，可引起T细胞凋亡。而CTLA-4基因的多态性可能通过改变CTLA-4蛋白的表达或功能而导致个体自身免疫性疾病的发生，表明CTLA-4基因或许是自身免疫性疾病的普遍易感性基因。GD是一种自身免疫性疾病，T细胞应答在GD发病过程中起重要作用，CTLA-4基因突变可能影响CTLA-4与B7亲和力，削弱其对T细胞的抑制作用，导致T细胞异常活化而引起疾病。CTLA-4基因SNP-318C等位基因较T等位基因有更高的促进细胞活化的作用，携带T等位基因时在刺激细胞表面有CTLA-4的高表达，在静止细胞表面有CTLA-4mRNA的表达增加,从而影响CTLA-4的水平[3-5]。
