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龋病是儿童最常见的一种口腔疾病。引起龋齿发生的因素很多，其中细菌因素是主要因素[1]。儿童龋病最主要的致病菌为变异链球菌和乳杆菌[2]，近年来有研究表明，双歧杆菌(Bifidobacterium)也可能是儿童深龋的致病菌之一[3]。双歧杆菌是口腔常驻菌，它与龋病的关系已逐渐被关注。双歧杆菌属是一群具有多形态、无动力的革兰阳性无芽孢厌氧菌，该菌属首先从婴儿粪便中分离得到，主要包括青春双歧杆菌、分叉双歧杆菌、栖牙双歧杆菌、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium，Bi.dentium)和殊形双歧杆菌等[4]。双歧杆菌对机体具有重要的生理作用，被称为人体益生菌(probiotic)，目前被大量添加在儿童饮品中。该菌属在人类口腔的分布尚不完全清楚，已分离到的主要为齿双歧杆菌、栖牙双歧杆菌和殊形双歧杆菌[5]。目前关于双歧杆菌与口腔疾病的相关研究较少，与儿童龋关系的研究就更少;而且尚未发现较好的分离人类口腔双歧杆菌的选择性培养基[6]，也限制了对该菌的研究。本研究在实验中探索出一种对口腔双歧杆菌选择性较好的培养基，并采用聚合酶链反应(polymerase chain re-action，PCR)技术检测患有重症婴幼儿龋(severe earlychildhood caries，S-ECC)和无龋儿童乳牙不同部位菌斑的双歧杆菌定植情况，初步探讨口腔双歧杆菌与儿童龋的相关关系，为生态防龋提供依据。
1 材料和方法
1.1 研究对象
随机选取40例2008年4月至9月期间就诊于四川大学华西口腔医院儿童口腔科的3~6岁患儿为试验组，其中女18例，男22例，平均年龄4.4岁。纳入标准：诊断为S-ECC的初诊儿童，1个月内未服用抗生素，无全身系统性疾病及其他口腔疾病。S-ECC诊断标准为[7]：3岁患儿的龋失补牙面数(decayed，missing or filled surfaces，dmfs)≥4，4岁患儿的dmfs≥5，5岁以上患儿的dmfs≥6。排除标准：口腔龋齿未达到S-ECC的诊断标准，1个月内服用过抗生素，全身抵抗力低下或患有系统性疾病。另外随机抽取四川省成都市武候区棕北金苹果幼儿园30例3～6岁无龋儿童作为对照组，其中女14例，男16例，平均年龄4.7岁。对照组要求检查前1个月内未服用抗生素，无系统性疾病和先天性疾病。试验前向2组儿童的父母说明实验目的和过程，并签署知情同意书。
1.2 双歧杆菌选择性培养基的制作及部分试剂
经过多次筛选，本试验采用经过改良的TPY双歧杆菌选择性培养基培养双歧杆菌。在青岛高科园海博生物技术有限公司提供的TPY双歧杆菌选择性培养基的基础上，室温下在每100 mL培养基加入氯化锂0.3 g、山梨酸0.04 g、丙酸钠1 g，pH值调整为6.5(25 ℃)，高温灭菌后再加入卡那霉素100 μg·mL-1、硫酸新霉素200 μg·mL-1。采用全基因组DNA提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)提取细菌DNA，用于PCR的特异性引物由大连宝生物工程有限公司合成医.学.全.在.线www.lindalemus.com。
1.3 菌斑标本的收集
样本收集前要求患儿用清水漱口1 min，然后用无菌牙签收集菌斑标本。对照组(无龋组)儿童收集唾液和混合菌斑，菌斑样本至少取3个牙面(包括唇面、邻面和面);试验组(S-ECC组)儿童分别取唾液、光滑面菌斑、牙面白垩斑菌斑及深龋龋坏组织。菌斑收集后，各自分装于预先经过消毒灭菌、装有转送液的EP管中(其中S-ECC组龋齿样本中预先放置玻璃珠)，1 h内送到实验室完成接种。
1.4 细菌的接种和分离
将转送的样本混匀，在无菌操作台上各取15 μL接种于改良过的选择性培养基，接种后放置厌氧培养箱专性厌氧培养48~72 h。挑选特征性菌落做革兰染色、耐氧实验和Rogosa培养基的鉴别培养，将选择出的细菌进行纯化培养、生化试验和DNA鉴定。为避免遗漏，将一部分样本接种后的第2代混合细菌直接提取DNA，其后用双歧杆菌的特异性引物进行种属鉴定。
