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1.5 双歧杆菌特异性引物及细菌通用引物的设计根据Genebank上双歧杆菌的16S rRNA基因序列[3]、参考文献重复率较高的引物及引物合成公司(大连宝生物工程有限公司)的建议设计本试验所用引物的基因序列，分别设计了细菌的通用引物、双歧杆菌属特异性引物[8]和齿双歧杆菌特异性引物[9]。本试验引物序列及预计扩增长度见表1。
1.6 细菌DNA的提取及PCR反应
将备用的细菌离心，收集沉淀，按照细菌DNA提取试剂盒的要求提取总DNA，-70 ℃保存。PCR反应体系的总体积为25 μL，其中Tag酶12.5 μL，10 μm·L-1上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，去离子水9.5 μL。混匀后离心5 s。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，然后95 ℃变性30 s，56.7 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃最终延伸5 min。PCR扩增产物在质量分数为1.5%琼脂糖凝胶和Tris硼酸盐乙二胺四乙酸(Tris/borate/ethylenediaminotetraacetic acid，TBE)缓冲液中电泳30 min，电压220 V。采用Bio-Rad凝胶成像系统观察并记录电泳条带。
1.7 统计分析
用SPSS 10.0统计软件对S-ECC组和无龋组儿童菌斑中双歧杆菌的检出率进行2个率比较的卡方检验分析，对S-ECC组儿童不同部位的双歧杆菌检出率进行行乘列表的卡方检验分析。检验水准为双侧α=0.05。
2 结果
经细菌的分离培养、生化鉴定及PCR鉴定，2组儿童的双歧杆菌检出率见表2，同一儿童不同部位的双歧杆菌和齿双歧杆菌的检出率见表3。由表2可见，40例S-ECC组儿童中有19例检出双歧杆菌，30例无龋组儿童均未检出双歧杆菌(表2)，2组检出率的差异有统计学意义(P<0.05)。由表3可见，儿童口腔不同部位的双歧杆菌检出率的差异无统计学意义，齿双歧杆菌在不同部位检出率的差异也无统计学意义(P>0.05)。对PCR产物电泳图进行分析，结果显示：所有样本均有细菌通用引物的PCR产物表达;检出双歧杆菌的样本既有细菌通用引物的表达，又有双歧杆菌通用引物的表达(图1);检出齿双歧杆菌的样本，既有上述2种通用引物的表达，又有齿双歧杆菌特异性引物的表达(图2)。M：DNA Marker;S：唾液;W：白垩斑菌斑;D：龋坏组织;1：双歧杆菌通用引物;2：细菌通用引物医.学.全.在.线www.lindalemus.com。
3 讨论
菌斑细菌在龋病发病中占有重要地位。根据生态菌斑学说，儿童龋的发生并不是单一致龋菌的作用，而是口腔生态平衡失调导致由变异链球菌、乳杆菌、放线菌、韦荣菌、奈瑟菌等口腔常驻菌共同作用的结果[10]。本研究结果显示，30例无龋儿童均未检出双歧杆菌，40例S-ECC儿童有19例检出双歧杆菌，检出率为47.5%。双歧杆菌在不同部位的检出率分别为：唾液27.5%，光滑面菌斑27.5%，白垩斑菌斑20.0%，深龋龋坏组织22.5%;齿双歧杆菌在不同部位的检出率分别为：唾液10.0%，光滑面菌斑7.5%，白垩斑菌斑7.5%，深龋龋坏组织10.0%。由此可见，双歧杆菌在S-ECC儿童龋齿发生的不同阶段均有检出，推测其存在和口腔环境有关，并伴随龋齿发生发展的全过程;齿双歧杆菌的检出情况也证明其为口腔双歧杆菌的活跃菌种[11]。本试验进行的PCR鉴定结果显示：S1、W1、D1为不同部位样本与双歧杆菌通用引物扩增的PCR产物;S2、W2、D2为其与细菌通用引物扩增的PCR产物(图1);所有样本均有细菌通用引物的扩增产物，但只有定植着双歧杆菌的样本才有其特异性表达。在口腔双歧杆菌中，齿双歧杆菌最早被检出，其性状也最为活跃，S3、W3、D3为其PCR扩增产物的特异性表达(图2)。Becker等[3]的研究表明，S-ECC儿童的双歧杆菌检出率可达70%，并推测它可能是深龋的主要致龋菌。
