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1.3 Western blot
细胞经裂解提取蛋白后，经SDS-PAGE电泳分离后，转膜至PVDF。采用5%的脱脂牛奶室温封闭1 h，将一抗、二抗孵育后，采用增强型的化学发光液检测条带信号。膜重孵鼠单抗 α-tubulin作为内参对照。
1.4 统计学分析
数值采用均值±标准差表示。采用单因素方差分析结合Bonferroni校正分析多组间的统计学差异，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
SphK1突变抑制了高糖诱导MC的FN表达，MC分别转染空质粒Vector和突变型质粒SphKG82D。结果表明，高糖能明显上调FN 的表达；转染了SphKG82D质粒后显著抑制了高糖诱导的FN表达，而转染Vector质粒无此效应，证明SphK1参与了高糖诱导的FN表达。
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系膜细胞是肾脏的主要功能细胞，糖尿病状态下，肾小球系膜细胞FN等细胞外基质成分的积聚是导致肾小球硬化、促进糖尿病肾病病变形成的重要特 征。因此，我们采用体外实验进一步探讨高糖环境下肾小球系膜细胞S1P信号通路的激活与细胞外基质成分FN生成的关联性，以明确高糖激活的S1P信号通路 参与糖尿病肾病病理进程的作用机制。
SphK1是催化S1P生成的关键酶[2，4，5]。研究表明：长期高血糖、AGEs、氧化应激等可激活SphK1，进而导致S1P的生成增 加[6-9]。以往研究表明S1P在肾小球系膜疾病中起着重要作用[10-12]。外源性S1P可显著促进GMC增殖[10-12]，导致肾脏疾病的发 生。
近年来，SphK1-S1P信号通路与包括糖尿病肾病在内的糖尿病性血管并发症的关系日益受到关注，成为相关领域研究的热点。慢性高血糖现被 认为是糖尿病微血管及大血管病变的主要致病因素；血管内皮损伤是导致糖尿病慢性血管病变的起始环节[13]。研究发现，高血糖能够诱导内皮细胞SphK1 的活化，参与了内皮损伤过程。同样在高糖培养的内皮细胞中SphK活性也有显著增加，采用siRNA技术证明高糖主要激活SphK16。高血糖状态下形成 的AGEs现已证明是外周微血管病变的主要致病因素之一，导致糖尿病肾病和终末期肾衰竭。Geoffroy等用AGEs处理GMC，发现当AGEs低浓度 时，神经酰胺酶和鞘氨醇激酶活性明显升高，导致S1P积聚，诱使GMC增殖。Geoffroy随后观察了STZ诱导小鼠4 d后肾脏中SphK1活性和S1P含量的变化，结果发现随着肾小球系膜细胞轻度增殖，肾脏中SphK1活性和S1P均显著增加，提示SphK1-S1P信 号通路可能参与了糖尿病肾小球增殖过程[8，9]。
本研究发现：在正常糖培养情况下，MC经过高糖培养后，FN的表达显著升高，而转染突变型质粒SphKG82D的MC，几乎完全抵消高糖诱导 的MC中FN上调效应，提示高糖诱导的FN过度表达需要SphK1的参与调节，为探寻将SphK1-S1P信号通路作为抗糖尿病肾病的可能作用靶点奠定基 础。 [参考文献]
[1] Raptis AE， Viberti G. Pathogenesis of diabetic nephropathy[J]. Exp Clin Endocrinol Diabetes，2001，109 Suppl 2：S424-437.
