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1.2.2 MTT法 肝癌HepG2细胞用0.25%胰酶处理制成单细胞悬液，以每孔约104个细胞接种于96孔板（每孔100 μL)。分别加入不同浓度的苦参碱溶液，使其终浓度为0.5、1.0、2.0 mg/mL，每个浓度设三个孔。然后在加培养液100 μL，每孔总体积为200 μL，同时设定空白孔及对照孔。然后放回CO2箱中培养24、36、48 h。分别在各个时间段结束前4 h加入MTT（5 mg/mL)溶液10 μL，反应4 h离心弃上清液。每孔加入DMSO 150 μL振荡荡5～10 min。用酶标仪测定波长为490 nm 的吸光值。根据公式计算：肿瘤细胞增值抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。
1.2.3 流式细胞术分析细胞周期 肝癌HepG2细胞以5×104/mL接种至6孔板中，细胞贴壁后，分别加入0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL的苦参碱，培养36 h后，收集细胞，并用流式细胞仪行细胞周期分析。
1.2.4 单磺酰戊二胺（ monodansylcadaverine， MDC)荧光染色 将DMEM液培养的肝癌HepG2细胞以1×104/mL接种至12孔板中，待细胞贴壁后，分别加入0.5、1.0、2.0 mg/mL的苦参碱，培养36 h弃培养液，用PBS液洗2遍，加入50 μmol/L MDC，37℃孵育10 min染色。再用PBS漂洗细胞3次，在荧光显微镜下观察。
1.3统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件分析数据，计量资料采用x±s表示，组间比较采用重复测量方差分析。检验水准（α)为0.05。多组间计量资料采用单因素方差分析检验；两组间计量资料采用t 检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 苦参碱显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖
MTT测定结果见图1，苦参碱显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖，并呈现时间-剂量依赖性。见表1。苦参碱0.5、1.0、2.0mg/mL 作用于肝癌HepG2细胞36 h后的抑制率分别：（17.21±2.02)%、（28.25±3.20)%、（38.77±5.58)%。
2.2流式细胞仪检测结果
不同浓度苦参碱作用于肝癌HepG2细胞36 h后，流式细胞仪分析细胞周期见表2。结果所示：不同浓度苦参碱作用于肝癌HepG2细胞中36 h后，G1期细胞增多，S期细胞减少，呈现剂量依赖性。结果表明苦参碱将肝癌HepG2细胞阻滞在细胞周期的G1期。
2.3 MDC染色显示苦参碱诱导肝癌HepG2细胞自噬的产生 医.学全.在.线网站www.lindalemus.com
为了研究苦参碱是否诱导了肝癌HepG2细胞自噬的产生，本文用荧光镜观察MDC染色的肝癌HepG2细胞，细胞显著的形态学变化如图2所示。MDC是自噬泡的特异性标记物荧光显微镜下观察细胞时，胞质内可见到清晰的点泡状结构，表明苦参碱诱导了自噬 的产生。
A～C：分别为0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL浓度的苦参碱作用于肝癌HepG2细胞后，胞质内可见到大量MDC标记的自噬颗粒。箭头所指为MDC标记的自噬泡 3 讨论
原发性肝癌是恶性程度最高的肿瘤之一。全球男性发病率位于恶性肿瘤的第5位，死亡率居恶性肿瘤的第2位；全球女性发病率位于第7位，死亡率位 于第6位。全球每年新发肝癌约75万人，而我国占半数以上[6]。由于肝癌具有恶性程度高、病情发展快、预后差、死亡率高等特点，多数就诊时已属晚期。目 前手术治疗依然是肝癌的首选，但是肝癌发病隐匿， 确诊时能手术者仅占l0%～15%，因此必须联合其他非手术措施（如化疗、生物治疗等)进行综合治疗，才能有望提高肝癌患者的长期生存率[7]。近年来， 苦参碱作为一种新型化疗药物，具有疗效显著、副作用小、毒性低等特点应用于临床。
苦参碱（Matrine)是中药苦参、山豆根、苦豆子的主要活性成分，具有保护肝细胞、抗病毒、抗过敏等多种药理作用[8]。此外苦参碱具有 广泛的抗肿瘤作用。研究发现：在体外实验中苦参碱可明显地诱导人乳腺癌[9]、骨肉瘤[10]及肝癌细胞[11]等的凋亡。苦参碱的抗肿瘤的作用机制很 多，主要包括诱导肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、诱导细胞自噬以及细胞毒等多种作用[3，12-13]。本实验结果表明：苦参碱对人肝癌HepG2细胞 有明显的抑制作用，不同浓度的苦参碱作用不同时间后，肝癌细胞的存活率降低，这种抑制作用呈时间和剂量依赖性。流式细胞仪分析细胞周期结果：苦参碱作用于 人肝癌HepG2细胞后， G1 期细胞数目明显增多，S期细胞数目减少（P < 0.05)，这表明苦参碱作用肝癌细胞后将细胞周期阻滞在G1期，使细胞不能进入S期进行DNA合成，并最终抑制了肝癌HepG2细胞的抑制，本文实验结 果与以往郭丹等[14]、夏宝妹等[15]、杨道科等[16]在肝癌、子宫内膜癌以及结肠癌细胞中的研究结果一致。同时荧光显微镜检测：苦参碱诱导肝癌 HepG2细胞自噬泡的产生，这表明自噬参与了苦参碱抑制肝癌HepG2细胞的增殖，可能提示苦参碱作用于肝癌HepG2细胞后，自噬多发生在细胞周期的 G1期。而自噬作为一把双刃剑，它与肿瘤之间的关系错综复杂，既可以促进肿瘤的生长，也可以诱导肿瘤的生长，在本实验研究中认为它参与了苦参碱抑制肝癌细 胞的增殖。本文在既往研究的基础上，探讨了苦参碱对人肝癌HepG2增殖及其细胞自噬的影响，而其发生的信号通路及其作用机制仍需作进一步的研究。希望本 实验研究能为细胞周期与肿瘤的增值、分化等之间的关系提供研究基础，为临床进一步更好的治疗肝癌提供理论基础。
