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清肝抑纤饮及其拆方对肝纤维化大鼠TGF-β1的影响
0 引言
肝纤维化是慢性肝病最常见的病理改变之一，是指肝脏纤维结缔组织的过度沉积，其病理特征为汇管区大量纤维组织异常增生，是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变和必经途径，而TGF-β1 是肝纤维化过程中最重要的促肝纤维化因子。肝纤维化是肝硬化的前趋阶段，既可逆转至正常，又可继续发展成肝硬化，所以抗肝纤维化的研究是近年来肝病研究中的热点。本文通过整方与不同拆方间对比，研究清肝抑纤饮预防用药对CCl4 致肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1及TGF-β1mRNA的影响，以探讨清肝抑纤饮防治肝纤维化的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF 级雄性Wistar 大鼠，110 只，体重160-180g。标准普通饲料。
1.2 动物用药
清肝抑纤饮组（A 组)：蒲公英15g、生甘草6g、败酱草15g、丹参12g、赤芍15g、三七9g、百合15g、枸杞15g、五味子6g；清热解毒组（B 组)：蒲公英15g、生甘草6g、败酱草15g；凉血活血组（C 组)：丹参12g、赤芍15g、三七9g；补肾柔肝组（D 组)：百合15g、枸杞15g、五味子6g；合药1 组（E 组)：B 组+C 组；合药2 组（F 组)：B 组+D 组；合药3 组（G 组)：C 组+D 组。药物水煎浓缩处理。A 组含生药0.972 g/ml，B、C、D 组含生药0.648 g/ml，E、F、G 组含生药0.324 g/ml。
1.3 动物造模用药
CCl4 分析纯；市售花生油。CCl4 与花生油以4：6 配成体积分数为40％ 的CC14-花生油溶液备用。
1.4 主要试剂和仪器
TGF-β1 及TNF-α ELISA 试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；EasyScript First-StrandcDNA Synthesis SuperMix 购自北京全式金（ Transgen ) 公司： β-actin 上游引物：TGTTGTCCCTGTATGCCTCTG、下游引物：ACCGCTCATTGCCGATAGTG；TGF-β1 上游引物：ACCGCAACAACGCAATCTATG、下游引物：AAAGCCCTGTATTCCGTCTCC。DL2000 Ladder Marker（条带组成100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp)、琼脂糖、溴化乙锭（EB)购自宝生物工程（大连)有限公司；X Easy Taq、PCR SuperMix 购自北京全式金（Transgen)公司。
美国伯乐BIO-RAD 680 型酶标仪；酶免大师 V1.0 分析软件：北京元业伯乐科技发展有限公司；德国Leica DM4000B 光学显微镜；德国Leica Qwin V3 图像分析软件；法国GILSON 公司移液器；美国Bio-rad 伯乐MyCycler 梯度PCR 仪；凝胶电泳仪；BIO-RAD 紫外分析仪；微型离心机；BECKMAN 超低温离心机；全系列伯乐Bio-rad 电泳仪。
1.5 动物分组及处理
110 只Wistar 大鼠随机分为9 组（A 组、B 组、C 组、D 组、E 组、F 组、G 组、模型组、空白对照组)。除空白对照组外均给予四肢或背部皮下注射40%CCL4-花生油溶液，按照0.3ml/100g，每周注射两次，同时给予相应中药及生理盐水灌胃，共8 周。8 周后处死大鼠，取同部位同样大小肝组织1 块，液氮速存，同时于相同部位取1.0×1.0×1.0cm 大小肝组织低温下加生理盐水做成10％的匀浆待测。
1.6 检测指标及方法
1.6.1 固相夹心法酶联免疫吸附试验法（ELISA)检测TGF-β1 步骤
分别于反应孔内加入稀释好后的标准品（1:20 蒸馏水稀释)和待测样品50 μl；37 ℃温育30 min；加入50 ul 的酶标记的溶液，盖上板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 min；甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4 次；每孔加入底物A、B 各50 μl，轻轻振荡混匀，37℃温育15 min，避免光照；取出酶标板，迅速加入50 μl 终止液，加入终止液后立即测定结果；于450 nm 波长处测定各孔的OD 值，以吸光度OD 值为纵坐标（Y)，相应的标准浓度为横坐标（X)，做得相应的曲线，根据其OD 值由标准曲线换算出相应的浓度。
1.6.2 逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR)检测TGF-β1 mRNA
（1) RNA 抽提 取约100 mg 组织放于玻璃研磨器内，加0.2 ml 的Trizol 溶液，研磨组织后，倒入1.5 ml EP 管中，再在研磨器内加入0.8 ml 的Trizol 溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10 下，室温静置5 min。每1 ml Trizol 中加0.2 ml 氯仿。盖紧样品管盖医学.全在线www.lindalemus.com，用手用力摇晃试管15 s，使其充分混匀，室温静置5 min。后12000 rmp 离心15 min。将上层水相转入新的1.5 ml EP 管中（约400-500 ul)，加入0.5 ml 异丙醇，混匀后放于-20℃中1 小时，后12000 rmp 离心10 min。倒掉上清，留取沉淀，加1 ml 75%的乙醇（预冷)振荡洗涤RNA 沉淀一次，后7500 rmp 离心5 min。倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干，再在管中加20 μl 的DEPC 水溶解，在55-60 ℃下孵育10 min 助溶。提取的RNA 保存于-70℃超低温冰箱中。
（2) 第一链cDNA 合成（20 μl 体系)，如表1 所示。42 ℃ 孵育30 min；85 ℃加热5 min 失活EasyScript RT。
（3) PCR 反应（20 ul 体系)，如表2 所示。循环参数如下：94℃ 3 min 热启动进入循环；35 个循环：94 ℃变性30 s；58 ℃退火30 s；72℃延伸30 s，经35 个循环扩增后72℃终延伸10 min。
（4) PCR 产物电泳 1.5%TAE 琼脂糖凝胶EB 染色，上样量5 μl，电压80 V/电流40mA，电泳40 min，进行紫外分析。
1.7 统计方法
所有数据以SPSS17.0 for Windows 统计软包进行统计分析，计量资料多样本均数比较采用one-way ANOVA 软件进行方差分析，结果以X ±S 表示。
2 实验结果
2.1 TGF-β1 固相夹心法酶联免疫吸附试验法检测结果
由中可以看出，模型组肝组织匀浆TGF-β1 浓度明显高于空白对照组，经统计，两者比较有显著性差别，P<0.01。各治疗组均可降低TGF-β1 的肝组织浓度，其中清肝抑纤饮全方组与清热解毒+凉血活血组TGF-β1 浓度值下降明显，与模型组比较，均有显著性差异，P<0.01。清肝抑纤饮全方组疗效优于清热解毒+凉血活血组，但两组间比较无显著性差异。其他各治疗组也不同程度使肝组织匀浆TGF-β1 下降，按照疗效由强至弱依次为：F 组、G组、B 组、D 组、C 组，其中F 组、G 组、B 组分别与模型组相比，均有显著性差异，P<0.05。
2.2 RT-PCR 法检测TGF-β1 mRNA 表达
扩增产物行电泳后，可见β-actin 及TGF-β1 片段大小分别约为348 bp、308 bp。RT-PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳后，用凝胶成像系统进行光度扫描，以TGF-β1/β-actin 的光度比值表示TGF-β1 表达水平。模型组比值明显高于空白对照组（P<0.01)。各治疗组中，A 组、E 组及F 组比值下降明显，分别与模型组相比，均有显著性差异，P 值均小于0.01。A 组疗效优于E、F 组，与E 组间比较无显著性差异。余治疗组中按疗效由强至弱依次为G组、B 组、D 组、C 组，其中G 组与模型组比较亦有显著性差异，P<0.01。
3 讨论
肝纤维化的形成是细胞、细胞因子、细胞外基质间相互作用、相互调节的结果，细胞因子作为免疫调节介质在肝纤维化的发生发展过程中起着重要作用，它们通过旁分泌和自分泌方式作用于靶细胞特定受体，介导细胞与细胞间的相互作用，发挥局部生物学效应。在众多的细胞因子中，以TGF-β1 与肝纤维化形成的关系最为密切，为现知的最强烈的肝纤维化促进因子，主要参与调节细胞的增殖、分化、黏附、转移、ECM 成分的表达、降解以及免疫反应。在肝纤维化的发生、发展过程中具有活化HSC、促进胶原基因表达、促进ECM 合成与沉积的作用，是肝纤维化最重要的始动因子之一，其表达水平与肝纤维化严重程度呈显著正相关，是目前研究最深入的致肝纤维化的细胞因子。
肝脏含量最高且具有生物活性的是TGF-β1，可促使HSC 转化为肌成纤维细胞并分泌胶原纤维；具有强烈促进细胞外基质合成的作用，可上调HSC 表达I、Ⅲ、Ⅳ型胶原和LN，促进静息HSC 的激活；并通过抑制MMPs 的合成、促进TIMPs 及纤溶酶原激活物抑制因子-1 的生成而抑制ECM 降解。此外，尚能促进肝窦内皮细胞、枯否细胞等合成和分泌TGF-β、表皮生长因子等促纤维化细胞因子，进一步激活HSC，促进细胞外基质的分泌，促进肝纤维化的发展[2-5]。
本文针对肝纤维化病因病机的主要环节，组方清肝抑纤饮，取丹参、败酱草共为君药，前者和血活血，化瘀通络，后者清热解毒，针对病因；赤芍、蒲公英为臣药，凉血活血，兼清肝经郁热；百合、五味子、枸杞三者补肝肾阴，以固其本，三七活血化瘀，佐助君药，生甘草既有清热解毒之功，又兼调和诸药之用。采用动物实验的方法，通过整方与不同拆方间对比，探索清肝抑纤饮预防用药对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1 及TGF-β1 mRNA 的影响，结果显示模型组TGF-β1 水平明显高于空白对照组，经统计，有显著性差别，P<0.01，与文献报道一致[6-7]。清肝抑纤饮及其拆方预防用药可显著降低纤维化大鼠肝组织匀浆TGF-β1含量，各治疗组中以全方组与清热解毒+凉血活血组效果最为明显，分别与模型组比较，均有显著性差别（P<0.01，P<0.01)。全方组疗效优于清热解毒+凉血活血组，经统计，无显著性差异。RT-PCR 法检测TGF-β1 mRNA 表达，结果显示扩增产物行电泳后, TGF-β1 mRNA条带位于308 bp ,以TGF-β1/β-actin 的光度比值表示TGF-β1 mRNA 表达水平，结果与肝组织匀浆检测的TGF-β1 浓度结果一致。以上结果充分说明，清肝抑纤饮及其拆方能从mRNA到蛋白水平显著降低肝组织内TGF-β1 的表达，从而阻断纤维化形成过程中细胞因子网络传递，是其防止肝纤维化形成和抑制其进展的重要作用环节之一。拆方研究发现，清肝抑纤饮组与合药1 组在降低肝组织匀浆TGF-β1 含量上无显著性差别，因此推测，清热解毒药物与凉血活血药物的配伍在方中起主要作用。
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