1.Sanger双脱氧链终止法
DNA的合成总是从5′端向3′端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引导核酸链。DNA的合成过程中,在合成的DNA链的3′末端,依据碱基配对的原则,通过生成新的3′,5′-磷酸二酯键,使DNA链合成终止,产生短的DNA链。具体测序工作中,平行进行四组反应,每组反应均使用相同的模板,相同的引物以及四种脱氧核苷酸;并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸,使其随机地接入DNA链中,使链合成终止,产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开,经过放射自显影显示区带,就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列(图15-3)。
图15-3 双脱氧链终止法测定DNA序列原理示意
2.MaxamGilbert DNA化学降解法
这一方法的基本步骤为(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P;(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰;(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链;(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开;(5)根据放射自显影显示区带,直接读出DNA的核苷酸序列(图15-4)。
图15-4 化学裂解法测定DNA的核苷酸序列