（4)靶DNA变性：将载片浸入70℃变性溶液（70%甲酰胺，2×SSC)2min。新鲜的变性溶液需每周配制，贮存于4℃冰箱中备用。一张处于室温的载片放入50ml的染色缸（coplin jar)内，将会使溶液温度减低约1℃，因此，每次应加入少量玻片，以免影响溶液的温度致变性不完全。冷却变性处理后的载片可放在冰上或浸入70%酒精溶液1min。漂洗加震动以终止反应和彻底去除变性溶液。然后经梯度酒精脱水（80%，90%，100%)，空气干燥。

　　（5)杂交液的准备

　　　MM₁  甲酰胺5.0ml

　　硫酸葡聚糖1.0g

　　20×SSC　　　　　　　1.0ml

　　（或50%硫酸葡聚糖)2.0ml

　　MM₂ 甲酰胺　　　　　　　5.5ml

　　硫酸葡聚糖1　　　.0gm

　　20×SSC　　　　　0.5ml

　　首先将溶液在70℃加温，以溶解硫酸葡聚糖，冷却后调整pH至7.0,容量加至70ml。这容量是最后应用的杂交混合液的70%，其余的30%为核酸探针和水（如果需要的话)。MM₁给预杂交混合液是：50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖2×SSC。Trask发现MM₂效果较MM₁好，DNA的Tm比MM₁低-8℃。在2×2cm区域杂交混合液应为：MM₁7μl，DNA探针（保存液为500μg～10mg/ml)1μl，加探针混合液2μl，总量为10μl。

　　（6)杂交：每张盖玻片加10μl杂交混合液，注意移除气泡，可在盖片四周加橡皮泥封固，在37℃湿盒中过夜。

　　（7)漂洗：从温箱中取出后，以镊子移除橡皮泥，从现在起注意勿使载片干燥。否则盐的晶体将产生非特异性背景染色，漂洗应用2×SSC（pH7)在45℃3min×3。不时震动以助彻底漂洗，盖玻片将在漂洗中自然移除。然后再在2×SSC，45℃，2min×3。保存载片于PBS溶液内。

　　（8)荧光显示：

　　①生物素标记DNA探针的荧光显示。

　　1)应用PBS含5%无脂干奶（5μl每张盖片)，也可用1%牛血清白蛋白（BSA)-PBS覆盖孵育5min室温，以封闭非特异性结合部位。

　　2)移除多余液体，加抗生素-FITC（5μg/ml在PBS含5%奶粉或1%BSA，5μl/cm²)。在湿盒中，室温孵育20min。抗生物素-FITC在此应用是过量的，因此，可回收贮存4℃再次应用，其保存时间可达数周。反应见图20-4A直接法。

　　3)漂洗：PBs 2min×3，45℃。

　　4)如需放大（amplification),即提高其敏感度，可按图20-4B间接法加生物素化羊抗抗生物素抗血清（biotinylated goat – antivaidin antibody)30min室温。倾去加另一层抗生物素-FITC抗血清孵育20min，重复上述1)～3)。

　　②AAF标记核酸探针的荧光显示

1)封闭非特异性结合部位：从PBS中取出载片，吸干多余液体，加PBS-0.1%吐温（Tween)含2%正常羊血清（NGS)（5μl/每cm²盖玻片)。使载片停留在室温5min。

　　2)倾去多余液体，加抗-AAF抗血清1：750，PBS-Tween –NGS溶液（如上i)5μl/cm²盖玻片。室温37℃。孵育30min.

　　3)漂洗：PBS-0.1%Tween室温5min×3，间歇性振荡。

　　4)羊抗小鼠IgG-FITC孵育，1：300～1：1000在PBS-0.1%Tween含2%NGS，37℃孵育30min，如3)应用PBS-0.1%Tween 漂洗5min×3。

　　4．荧光标记DNA探针在细胞核混悬液杂交中的应用

　　（1)细胞核的分离：将培养的细胞制成细胞混悬液，或以胰蛋白酶消化法于培养盖上收集培养细胞。应用MgSO₄染色分离方法分离细胞核（Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章　)。细胞混悬液浓度为5×10⁶/ml。利用RNA酶消化后，使核从细胞分离，细胞核混悬液浓度为4～5×10⁶细胞核/ml。

　　（2)细胞固定和酸的处理：在5ml试管内加冷的100%酒精不断旋转以达到满意的固定。在冰上停留10min。在4℃离心（×150g)10min。重复加三次冷的100%酒精入试管内，离心，倾去。置于冰上10min，再离心。然后加入相当核悬液1/2量的0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室温停留10min。加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO₄, 5mmol/L HEPES pH8.0)。再离心，重复IBM漂洗（这时细胞核可在不染色情况下，以荧光显微镜观察)后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，继之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5mmol/l MgSO₄。在室温静置站立10min。倾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，离心，使细胞核混悬液最终浓度为10⁸/ml，（可用IBM-Triton X-100稀释约50倍，在血球计数器计数)，混悬液镜检应含单个，完整的细胞核。

　　（3)细胞核混悬液杂交

　　①配制杂交混合液：甲酰胺5份，20×SSC1份，50%硫酸葡聚糖2份，pH调至7.0。此原液（stock solution)可贮存在4℃冰箱内。应用时加1份10mg/ml鲱鱼精子DNA（herring sperm DNA)。

　　②混合1μl的细胞核混悬液（10⁸/ml)与18μl的杂交混合液，充分混匀。将此19μl混合液移入1.5ml容积的Eppendorf 管中（核含量约为10⁵)。

　　③加入100ng/每管的AAF标记DNA探针（如为生物素标记DNA探针浓度为20～40ng/每管)。

　　④置70℃10min使DNA探针和核DNA变性。

　　⑤和组织切片与DNA探针杂交方法相较，不同的是在加热变性后切勿置冰上迅速冷却以终止反应，而应迅速转入37℃孵育过夜。

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