(4)靶DNA变性:将载片浸入70℃变性溶液(70%甲酰胺,2×SSC)2min。新鲜的变性溶液需每周配制,贮存于4℃冰箱中备用。一张处于室温的载片放入50ml的染色缸(coplin jar)内,将会使溶液温度减低约1℃,因此,每次应加入少量玻片,以免影响溶液的温度致变性不完全。冷却变性处理后的载片可放在冰上或浸入70%酒精溶液1min。漂洗加震动以终止反应和彻底去除变性溶液。然后经梯度酒精脱水(80%,90%,100%),空气干燥。
(5)杂交液的准备
MM1 甲酰胺5.0ml
硫酸葡聚糖1.0g
20×SSC 1.0ml
(或50%硫酸葡聚糖)2.0ml
MM2 甲酰胺 5.5ml
硫酸葡聚糖1 .0gm
20×SSC 0.5ml
首先将溶液在70℃加温,以溶解硫酸葡聚糖,冷却后调整pH至7.0,容量加至70ml。这容量是最后应用的杂交混合液的70%,其余的30%为核酸探针和水(如果需要的话)。MM1给预杂交混合液是:50%甲酰胺,10%硫酸葡聚糖2×SSC。Trask发现MM2效果较MM1好,DNA的Tm比MM1低-8℃。在2×2cm区域杂交混合液应为:MM17μl,DNA探针(保存液为500μg~10mg/ml)1μl,加探针混合液2μl,总量为10μl。
(6)杂交:每张盖玻片加10μl杂交混合液,注意移除气泡,可在盖片四周加橡皮泥封固,在37℃湿盒中过夜。
(7)漂洗:从温箱中取出后,以镊子移除橡皮泥,从现在起注意勿使载片干燥。否则盐的晶体将产生非特异性背景染色,漂洗应用2×SSC(pH7)在45℃3min×3。不时震动以助彻底漂洗,盖玻片将在漂洗中自然移除。然后再在2×SSC,45℃,2min×3。保存载片于PBS溶液内。
(8)荧光显示:
①生物素标记DNA探针的荧光显示。
1)应用PBS含5%无脂干奶(5μl每张盖片),也可用1%牛血清白蛋白(BSA)-PBS覆盖孵育5min室温,以封闭非特异性结合部位。
2)移除多余液体,加抗生素-FITC(5μg/ml在PBS含5%奶粉或1%BSA,5μl/cm2)。在湿盒中,室温孵育20min。抗生物素-FITC在此应用是过量的,因此,可回收贮存4℃再次应用,其保存时间可达数周。反应见图20-4A直接法。
3)漂洗:PBs 2min×3,45℃。
4)如需放大(amplification),即提高其敏感度,可按图20-4B间接法加生物素化羊抗抗生物素抗血清(biotinylated goat – antivaidin antibody)30min室温。倾去加另一层抗生物素-FITC抗血清孵育20min,重复上述1)~3)。
②AAF标记核酸探针的荧光显示
1)封闭非特异性结合部位:从PBS中取出载片,吸干多余液体,加PBS-0.1%吐温(Tween)含2%正常羊血清(NGS)(5μl/每cm2盖玻片)。使载片停留在室温5min。2)倾去多余液体,加抗-AAF抗血清1:750,PBS-Tween –NGS溶液(如上i)5μl/cm2盖玻片。室温37℃。孵育30min.
3)漂洗:PBS-0.1%Tween室温5min×3,间歇性振荡。
4)羊抗小鼠IgG-FITC孵育,1:300~1:1000在PBS-0.1%Tween含2%NGS,37℃孵育30min,如3)应用PBS-0.1%Tween 漂洗5min×3。
4.荧光标记DNA探针在细胞核混悬液杂交中的应用
(1)细胞核的分离:将培养的细胞制成细胞混悬液,或以胰蛋白酶消化法于培养盖上收集培养细胞。应用MgSO4染色分离方法分离细胞核(Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章 )。细胞混悬液浓度为5×106/ml。利用RNA酶消化后,使核从细胞分离,细胞核混悬液浓度为4~5×106细胞核/ml。
(2)细胞固定和酸的处理:在5ml试管内加冷的100%酒精不断旋转以达到满意的固定。在冰上停留10min。在4℃离心(×150g)10min。重复加三次冷的100%酒精入试管内,离心,倾去。置于冰上10min,再离心。然后加入相当核悬液1/2量的0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室温停留10min。加入IBM-0.25%Triton X-100(IBM配方:50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO4, 5mmol/L HEPES pH8.0)。再离心,重复IBM漂洗(这时细胞核可在不染色情况下,以荧光显微镜观察)后,以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min,继之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5mmol/l MgSO4。在室温静置站立10min。倾去上清液,加IBm -Triton X-100漂洗,离心,使细胞核混悬液最终浓度为108/ml,(可用IBM-Triton X-100稀释约50倍,在血球计数器计数),混悬液镜检应含单个,完整的细胞核。
(3)细胞核混悬液杂交
①配制杂交混合液:甲酰胺5份,20×SSC1份,50%硫酸葡聚糖2份,pH调至7.0。此原液(stock solution)可贮存在4℃冰箱内。应用时加1份10mg/ml鲱鱼精子DNA(herring sperm DNA)。
②混合1μl的细胞核混悬液(108/ml)与18μl的杂交混合液,充分混匀。将此19μl混合液移入1.5ml容积的Eppendorf 管中(核含量约为105)。
③加入100ng/每管的AAF标记DNA探针(如为生物素标记DNA探针浓度为20~40ng/每管)。
④置70℃10min使DNA探针和核DNA变性。
⑤和组织切片与DNA探针杂交方法相较,不同的是在加热变性后切勿置冰上迅速冷却以终止反应,而应迅速转入37℃孵育过夜。